Entwicklung und Etablierung von Spermienfunktionstests beim Vogel - Krohn, Judith; Justus Liebig University Giessen (My University, 2016)
Ziel der Arbeit war es, einen Spermienfunktionstest zu etablieren, bei dem die sepa-rierte innere Perivitellinmembran (IPVM) als Testmedium für die Penetrationsfähigkeit von Spermien anderer Vogelspezies verwendet werden kann. Die zur Separation der IPVM verwendete Säureinkubationsmethode wurde in einem Vorversuch variiert, um die Separationseigenschaften von Hühnereiern bei Veränderungen der Inkubationszeit und der Säurekonzentration zu erfassen. Zusätzlich wurden die zu untersuchenden Eier verschiedenen Lagerungsbedingungen unterzogen, um den Einfluss der Lagerung auf die Separationseigenschaft zu untersuchen. Außerdem wurde die Säureinkubation zur Separation der IPVM bei Eiern sechs weiterer Vogelspezies angewendet.Die Anwendbarkeit der Säureinkubationsmethode bei bereits bebrüteten Eiern wurde in einem Versuch mit befruchteten und unbefruchteten Hühnereiern getestet, die bei 55% Luftfeuchtigkeit und 37°C über einen Untersuchungszeitraum von sieben Tagen bebrütet wurden.Im Perivitellin-Membran-Penetrationstest wurde die IPVM aus Hühnereiern isoliert und mit nativem und kryokonserviertem Hahnenejakulat, sowie nativem und flüssig-konserviertem Ejakulat von Falken und Nymphensittichen inkubiert. Die Penetrationsfähigkeit wurde anhand des Vorliegens von Hydrolyse-Löchern in der IPVM überprüft.Folgende Ergebnisse wurden erzielt:- Die besten Separationsergebnisse wurden mit dem Inkubationsprotokoll mit 0,01 molarer Salzsäure erzielt. Zwischen den beiden verwendeten Salzsäurekonzentrationen war der nachgewiesene Separationserfolg signifikant different. Zwischen der Inkubationszeit von 30 und 60 Minuten konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich des Separationserfolgs ermittelt werden.- Im Bezug auf den Einfluss der Lagerung konnte nur für die Lagerungsdauer, nicht für die Lagerungstemperatur und die Lichteinwirkung, ein statistisch signifikanter Einfluss auf den Separationserfolg nachgewiesen werden.- Die Bebrütungsdauer der Eier vor Separation hatte einen signifikanten Einfluss auf die Anwendung der Säureinkubationsmethode. Die Separation war ausschließlich bis zu einem Tag nach Beginn der Bebrütung möglich. Der Unterschied zwischen den befruchteten und unbefruchteten Eiern war nicht signifikant.- Bei der Untersuchung von Eiern anderer Vogelspezies außer dem Huhn konnte die IPVM aus Eiern von Hausgans und Nymphensittich nicht isoliert werden. Bei den Falkeneiern war die Separation nur bei 20% der Proben erfolgreich. Bei Fa-sanen-, Wachtel- und Laufenteneiern wurde die Separation der IPVM mit mindestens 40% Erfolgsquote erzielt.- Im Perivitellinmembran-Penetrationstest konnten durch eindringende Spermien verursachte Hydrolyse-Löcher in der aus Hühnereiern isolierten IPVM bei der In-kubation mit nativem und tiefgefrorenem Hahnensperma nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung mit Nymphensittich-Sperma gelang der Nachweis nur bei 10% der untersuchten Proben. Mit dem verwendeten Falkenejakulat kam es bei keiner der untersuchten Proben zu einer nachweisbaren Penetration von Sper-mien durch die IPVM von Hühnereiern.Mit der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass sich der Perivitellin-membran-Penetrationstest mit aus Hühnereinern isolierter IPVM nicht zum Nachweis der Penetrationsfähigkeit von Falkenejakulat und nur in sehr eingeschränktem Maße für Nymphensittichejakulat eignet. Ein speziesübergreifender Penetrationstest ließ sich nicht etablieren.

The aim of this study was to establish a functional sperm assay which uses the inner perivitelline layer (IPVM) of chicken eggs as a model to test the penetration ability of spermatozoa of other avian species. The acid hydrolysis used to separate the IPVM was varied in a preliminary test to investigate the separation ability of chicken eggs in accordance to acid concentration and incubation period. Fur-thermore the eggs were stored under different conditions to explore the influence of storage on the separation. Moreover the acid hydrolysis was applied to eggs of six other avian species.The possibility to use the acid hydrolysis in hatched eggs was investigated in a trial with fertilized and unfertilized chicken eggs which were hatched at 37°C and 55% humidity for seven days.In the perivitelline membrane penetration assay the IPVM isolated from chicken eggs was incubated with fresh and frozen-thawed chicken spermatozoa and fresh and diluted spermatozoa of falcons and cockatiels. Penetration of spermatozoa was tested by visualization of holes in the IPVM after incubation.The following relevant results were achieved:- The best separation of the IPVM was obtained with an acid concentration of 0,01 mol hydrochloric acid. There was a significant difference between the two tested acid concentrations. Between the incubation periods (30 minutes, 60 minutes) the difference of successful separation was not significant.- For storage conditions only the time of storage had a significant influence on the separation success. Neither temperature, nor light exposure had such an effect.- Time of hatching before separation had a significant influence on the application of acid hydrolysis. The separation was only induced up to one day after hatching. The difference between fertilized and unfertilized eggs was not significant.- Testing eggs from other avian species no separation was achieved in eggs of goose and cockatiel. With falcon eggs the separation was only induced in 20% of the sam-ples. At least 40% of samples were tested successful in eggs of pheasant, fowl and duck.- In the perivitelline membrane penetration assay holes produced by penetrating spermatozoa were found in the chicken IPVM after incubation with native and frozen-thawed cock sperm. With the cockatiel ejaculates holes were only found in 10% of the samples. Falcon spermatozoa did not produce any visible holes in the chicken IPVM at all.The present study shows that the perivitelline membrane penetration assay from chicken eggs is not suitable to investigate the penetration ability of falcon spermato-zoa. The appropriateness for cockatiel spermatozoa is severely restricted. A species-comprehensive perivitelline membrane penetration assay was not established.
Keywords: ddc:630