Charakterisierung des genetisch kodierten Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Sensors Mermaid zur Messung einer Änderung des Plasmamembranpotentials pulmonalarterieller glatter Muskelzellen unter hypoxischen Bedingungen - Dartsch, Ruth Charlotte; Justus Liebig University Giessen (My University, 2018)
Die Hypoxische Pulmonale Vasokonstriktion ist ein spezieller Mechanismus des pulmonalen Gefäßbettes zur Optimierung der Oxygenierung des Blutes bei lokaler oder generalisierter alveolärer Hypoxie durch Umverteilung des Blutes von schlecht belüfteten Lungenabschnitte in gut ventilierte Bereiche. Die Sensor- sowie Effektorzellen dieses Mechanismus sind präkapilläre pulmonalarterielle glatte Muskelzellen (PASMC). In der Vermittlung der ersten akuten Phase der HPV spielt der Ionenkanal TRPC6 eine essentielle Rolle, wobei die Signaltransduktionskaskade der Aktivierung noch nicht im Detail entschlüsselt ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von Mermaid zur Messung von Membranspannungsänderungen in PASMC der Maus, die aus einer Hypoxie-induzierten TRPC6-Aktivierung resultieren, um über diese Arbeit hinaus zur weiteren Entschlüsselung der TRPC6-aktivierenden Signaltransduktionskaskade zu dienen. Es wurden präkapilläre PASMC der Maus isoliert und mit Mermaid-Sequenz-enthaltenden Lentiviren infiziert. Nach Expression des FRET-Sensors in der Plasmamembran der PASMC wurde die Sensorreaktion bei Membranspannungsänderungen mithilfe unterschiedlicher Stimuli charakterisiert. Die Verifizierung der Sensorfunktionalität mit KCl in unterschiedlichen Konzentrationen zeigte nur für die höheren Konzentrationen eine gute Unterscheidbarkeit der unterschiedlichen Stimulierungsstärken, wobei die schwächste Konzentrationsstufe keinen signifikanten Unterschied zeigte. Die direkte Aktivierung von TRPC6 mit seinem membranpermeablen Aktivator OAG zeigte für alle verwendeten Konzentrationen keine mithilfe von Mermaid gemessene Membranspannungsänderung. Auch die Applikation von Hypoxie unter gleichzeitigem Priming durch den Vasokonstriktor ET-1 zeigte bei den vorliegenden Versuchsbedingungen keine mit Mermaid messbare Membranspannungsänderung im Vergleich zu normoxischen Kontrollen. Dass die in der vorliegenden Arbeit untersuchten PASMC der Maus eine Hypoxie-induzierte Membranspannungsänderung indirekt zeigen können, wurde mithilfe der auf Fura 2 AM basierten Mangan-Quenching Methode verifiziert. Zusammengefasst zeigte sich der FRET-Sensor Mermaid im vorliegenden Versuchsaufbau nicht geeignet zur Messung einer Hypoxie-induzierten Änderung der Plasmamembranspannung in präkapillären PASMC der Maus.

Hypoxic pulmonary vasoconstriciton is an intrinsic mechanism of the pulmonary vascular bed to optimise blood oxygenation in terms of localised alveolar hypoxia and diverts bloodflow from bad to well ventilated areas of the lung. The sensor and effector cells of this mechanism are precapillary pulmonary arterial smooth muscle cells. The ion channel TRPC 6 plays an essential role for the first acute phase of HPV, but the signaling cascade of its activation isn t still resolved in detail. The present study aimed for characterising the FRET-sensor Mermaid for measuring changes of the plasma membrane potential in mouse precapillary pulmonary aterial smooth muscle cells resulting from hypoxia-induced activation of TRPC6. Exceeding the present work the FRET-based plasma membrane potential measurement should help deciphering this TRPC6-activating signal transduction pathway. Mouse precapillary pulmonary aterial smooth muscle cells were isolated and infected by lentiviruses coding for the Mermaid-sequence. After expression of the sensor in the plasma membrane the sensor response to changes in membranvoltage was chararecterised with different stimuli. Evidence for the function of the sensor using potassiumchloride in different concentrations was given only for higher concentrations of potassiumchloride. The lowest stimulus did not show a significant change. Direct activation of TRPC6 by its membranepermeable activator OAG showed no changes of the plasma membrane potential measured by Mermaid for all tested OAG concentrations. Also the application of hypoxia with simultaneous priming with the vasoconstrictor Endothelin-1 showed no change of the plasma membrane potential measured by Mermaid in comparison to normoxic conditions with Endothelin-1 priming. Indirect evidence for the hypoxia-induced change of plasma membrane potential of mouse PASMC was measured by the Fura 2 AM based manganese quenching method.In summary, hypoxia-induced changes of plasma membrane potential in mouse precapillary pulmonray arterial smooth muscle cells are not detectable by the FRET sensor Mermaid with the used experimental setup.
Keywords: ddc:610