Die Rolle der Histonacetylierung für den Histon-Protamin-Austausch während der Spermiogenese von Mensch und Maus - Sonnack, Violetta; Justus Liebig University Giessen (My University, 2007)
Der Histon-Protamin-Austausch ist für die männliche Fertilität von entscheidender Bedeutung. Während die Expression von Protaminen in erster Linie durch den Transkriptionsfaktor CREM reguliert wird, spielt für den Histon-Protamin-Austausch die Acetylierung von Histonen eine wichtige Rolle. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Untersuchung von hyperacetyliertem Histon H4. Immunhistochemische Untersuchungen an menschlichem Biopsiematerial zeigten während der normalen Spermatogenese ein starkes Signal für hyperacetyliertes Histon H4 in den Kernen von Spermatogonien und elongierenden Spermatiden. Der Prozentsatz an immunpositiven Spermatiden lag bei 98.2 % ± 1.1 % und war signifikant erniedrigt bei infertilen Männern mit zumindest qualitativ normaler Spermatogenese (Score 10-8, 93.1 % ± 6.6 %) und gestörter Spermatogenese (Score 7-1, 74.9 % ± 23.4 %). In Hodentubuli mit Spermatogenesearrest auf der Stufe von runden Spermatiden waren sogar nur 59.5 % ± 16.5 % der Spermatiden positiv für hyperacetyliertes Histon H4. Hier zeigte sich zudem ein zusätzliches Signal in den Zellkernen von pachytänen Spermatozyten. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine gestörte Spermatogenese mit einer signifikanten Verringerung von für hyperacetyliertes Histon H4 positiven Spermatiden verbunden ist. Das vorzeitige Auftreten von hyperacetylierten Histon H4 in pachytänen Spermatozyten könnte über einen vorzeitigen Histon-Protamin-Austausch die Infertilität verursachen. So wurde in transgenen Mäusen gezeigt, dass die vorzeitige Expression von Protamin-1 zu Sterilität führt. Der Grad der Acetylierung von Core-Histonen wird durch zwei Enzyme kontrolliert, Histon-Acetyltransferasen (HATs) und Histon-Deacetylasen (HDACs). In isolierten Spermatiden der Maus wurde gezeigt, dass eine Behandlung mit dem HDAC-Inhibitor Trichostatin A (TSA) zu einem Anstieg der Acetylierung in runden Spermatiden führt. In der vorliegenden Arbeit wurde der in vivo Effekt von subkutan injiziertem TSA auf die Spermatogenese/Fertilität der Maus untersucht. Es zeigte sich eine Dosis-abhängige Abnahme des relativen Hodengewichts, die auf eine gestörte Spermatogenese zurückgeführt werden konnte. Männliche Mäuse wurden durch die TSA Behandlung vollkommen infertil. Dieses Phänomen war komplett reversibel. Interessanter Weise konnten keine Anzeichen einer Histon H4 Hyperacetylierung in runden Spermatiden gefunden werden. Jedoch nahm die Zahl der Spermatiden mit steigender TSA-Dosis signifikant ab. Zudem konnte eine dramatische Abnahme der Spermatozyten im Pachytän-Diplotän beobachtet werden, was auf eine gesteigerte Apoptose zurückgeführt werden konnte. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, daß TSA auf der Ebene der Meiose wirkte. Es konnte kein toxischer Effekt von TSA beobachtet werden. Die restlichen Reproduktionsorgane zeigten keine morphologischen Veränderungen gegenüber den Kontrolltieren, was darauf schließen läßt, dass die TSA Wirkung auf den Hoden nicht durch Sexualhormone vermittelt wurde. Männer mit Spermatidenreifungsdefekt zeigten eine signifikant verminderte Anzahl von Protamin positiven Spermatiden, assoziiert mit einer verfrühten (in Spermatozyten) und reduzierten (in Spermatiden) Hyperacetylierung von Histon H4. In vivo Applikation des HDAC-Inhibitor Trichostatin A führte in männlichen Mäusen zu einer reversiblen Infertilität. Histologische Untersuchungen zeigten eine Abnahme der Zahl der Spermatiden und pachytänen Spermatozyten, was vermuten lässt, dass TSA primär auf die Meiose wirkt.

Histone-to-protamine exchange in haploid spermatids plays a vital role for male fertility. While protamine expression is primarily regulated by the transcription factor CREM, acetylation of core histones is important for histone displacement. The present study focussed on hyperacetylated histone H4. Immunohistochemical investigations on human testis biopsies revealed a strong signal for hyperacetylated histone H4 in the nuclei of spermatogonia and elongating spermatids during normal spermatogenesis. The percentage of immunopositive spermatids was 98.2 % ± 1.1 % and was significantly decreased in infertile men with at least qualitative normal spermatogenesis (score 10-8, 93.1 % ± 6.6 %) and impaired spermatogenesis (score 7-1, 74.9 % ± 23.4 %). In seminiferous tubules with spermatogenic arrest at the level of round spermatids, only 59.5 % ± 16.5 % of spermatids were positive for hyperacetylated histone H4. Here, an additional signal was present in the nuclei of pachytene spermatocytes. These data demonstrate that impaired spermatogenesis is associated with a significant decrease of hyperacetylated histone H4 in spermatids. The precocious occurrence of hyperacetylated histone H4 in pachytene spermatocytes may result in a premature histone-to-protamine exchange causing infertility. It has been demonstrated in transgenic mice that precocious expression of protamine-1 results in sterility. The acetylation status of core-histones is regulated by two enzymes, histone-acetyltransferases (HATs) and histone-deacetylases (HDACs). In isolated murine spermatids, it has been demonstrated that treatment with the HDAC-inhibitor trichostatin-A is followed by an increase of acetylation in round spermatids. In the present study, the in-vivo effect of subcutaneously injected TSA on spermatogenesis/fertility of the mouse has been investigated. A dose-dependent decrease of the relative testis weight due to impaired spermatogenesis could be demonstrated. During the TSA treatment, male mice became infertile, a phenomenon that was completely reversible. No signs of histone H4 hyperacetylation in round spermatids could be observed, however, the number of spermatids significantly decreased with increasing TSA dose. In addition, a dramatic decrease of pachytene-diplotene spermatocytes could be observed. This was caused by apoptosis. Data suggest that TSA affects primarily meiosis. No toxic effect of TSA could be observed. In addition, other reproductive organs revealed no morphological changes when compared with control animals suggesting that the effect of TSA on the testis does not act via sexual hormones. Men with round spermatid maturation arrest exhibited a significantly decreased number of protamine positive spermatids and a both precocious (in spermatocytes) and decreased (in spermatids) hyperacetylation of histone H4. In-vivo application of the HDAC-inhibitor trichostatin-A resulted in reversible infertility in male mice. Histological examinations revealed a decreased number of spermatids and pachytene spermatocytes suggesting that TSA primarily affects meiosis.
Keywords: ddc:630