Untersuchungen zur Genexpression humaner Spongiosa-abgeleiteter Stromazellen nach Fragilitätsfraktur - Schaaf, Thimo; Justus Liebig University Giessen (My University, 2015)
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Erkenntnisse über die Genexpressionsmuster von humanen Stromazellen im Rahmen der Osteoporose zu gewinnen.So wurde die Expression ausgewählter Gene humaner Spongiosa-abgeleiteter mesenchymaler Stromazellen von Patienten mit einer Fragilitätsfraktur des Oberschenkelhalses untersucht. Da die Fragilitätsfraktur das typische klinische Erscheinungsbild der Osteoporose repräsentiert, wurden die Stromazellen der Frakturpatienten als osteoporotisch eingestuft. Als Kontrollen dienten Stromazellen von Patienten mit einer Coxarthrose. Von je acht Schenkelhalsfraktur- und sechs Coxarthrose-Patienten wurden Spongiosafragmente aus den zentralen Regionen der resezierten Oberschenkelköpfe entnommen. Die Spongiosaproben wurden in die Zellkultur überführt und daraus die multipotenten Stromazellen isoliert. Diese wurden anschließend sowohl über Zeiträume von 0, 7, 14 und 21 Tage im Standardmedium kultiviert, als auch osteogen und adipogen differenziert. Anschließend wurde aus der extrahierten RNA die relative Gen-Expression von osteogenen (BMP-2, Runx-2, Osteopontin, Osteocalcin), adipogenen (PPARgamma) und knochenresorptiven Faktoren (RANKL, OPG) mittel RT-qPCR bestimmt. Die Ergebnisse zeigten für Osteopontin einen signifikanten Anstieg der Genexpression bei undifferenzierten und osteogen differenzierten Zellen der Schenkelhalsfraktur-Patienten. Dieser Anstieg gibt einen möglichen Hinweis auf ein Regenerationsbestreben im Rahmen der initialen Frakturheilung, da das Matrixprotein vor allem die Adhäsion von Osteoblasten und deren Vorläuferzellen an die Knochenoberfläche vermittelt.Wenn auch kein Gruppenunterschied zwischen der Osteocalcin-Expression der Stromazellen von Coxarthrose- und Frakturpatienten bestand, so konnte dennoch der grundlegende Nachweis erbracht werden, dass bereits undifferenzierte Stromazellen dieses extrazelluläre Matrixprotein exprimieren.Ebenfalls keinen Unterschied zwischen den Gruppen konnte bei der Runx-2 Expression festgestellt werden. Allerdings kam es im Laufe der adipogenen Differenzierung zu einem Anstieg, was auf eine Interaktion osteogener und adipogener Differenzierungskaskaden hindeuten könnte.Darüber hinaus wurde die ambivalente Funktion von BMP-2 im Rahmen der Differenzierung mesenchymaler Stromazellen deutlich. Zum einen konnte eine signifikant niedrigere Expression in undifferenzierten Zellen von Schenkelhalsfraktur-Patienten nachgewiesen werden, was auf eine verminderte osteogene Differenzierungskapazität dieser Zellen hindeuten könnte. Zum anderen konnte die enge Verknüpfung des Differenzierungsfaktors mit der adipogenen Differenzierung gezeigt werden. So stieg die Expression des Gens bei dieser Differenzierungsrichtung an. Außerdem konnte eine positive Korrelation zwischen BMP-2 und PPARgamma ermittelt werden. Die Untersuchung der PPARgamma Expression nahm einen wichtigen Stellenwert mit Blick auf die Pathogenese der Osteoporose ein. Die adipogene Determinierung der Stromazellen konnte in der vorliegenden Arbeit nur bedingt nachvollzogen werden. So zeigten sich weder bei den undifferenzierten, noch bei den adipogen differenzierten Zellen Unterschiede zwischen den beiden Patientengruppen. Zellen aus der Frakturgruppe wiesen jedoch eine erhöhte Genexpression von PPARgamma im Rahmen der osteogenen Differenzierung auf. Mit Blick auf die zugrundeliegenden Mechanismen der Osteoporose war die wohl wichtigste Erkenntnis, dass es im Rahmen der adipogenen Differenzierung zu einem höchst signifikanten Anstieg der RANKL Expression kam. Dies deutet darauf hin, dass eine im Alter auftretende Verfettung des Knochenmarks aktiv die Knochenresorption begünstigt. Außerdem konnte in der Fraktur-Gruppe eine positive Korrelation zwischen Runx-2 und RANKL bei osteogen differenzierten Zellen festgestellt werden, was zu der Annahme führt, dass die osteogene Differenzierung von Stromazellen osteoporotischer Spender mit einem Abbau des Knochengewebes einhergehen könnte. Die Rolle von OPG als gegensätzlich regulierter Antagonist von RANKL wurde durch die vorliegenden Ergebnisse bestätigt.

The aim of the present study was to investigate gene expression pattern of human spongiosa-derived osteoporotic mesenchymal stromal cells. The fragility fracture of the femoral neck is the typical clinical sign of osteoporosis, so cells isolated from these patients were considered as osteoporotic cells. In contrast, cells from patients with hip osteoarthritis were defined as control group. Cancellous bone fragments were isolated from the center of the femoral head of eight osteoporotic and six osteoarthritic patients. Of these samples multipotent stromal cells were isolated under cell culture conditions. Then the cells were cultured both in standard medium for a period of 0, 7, 14 and 21 days and in osteogenic and adipogenic differentiation medium. Subsequently RNA was isolated and the expression of osteogenic (BMP-2, Runx-2, Osteopontin, Osteocalcin), adipogenic (PPARgamma) and bone resorption factors (RANKL, OPG) was measured via RT-qPCR. The expression of osteopontin was significantly higher in osteoporotic cells cultured in standard and osteogenic medium than in cells of the control group. This increase might be a part of the initial fracture healing process, because this matrix protein mediates the adhesion of osteoblasts and their precursors at the bone surface.Although no difference between the osteoporotic and the osteoarthritic group was detected, this study showed, that undifferentiated multipotent stromal cells isolated from cancellous bone are competent to produce osteocalcin.There were also no significant differences in the expression of Runx-2 between the two investigated groups at any time point. However, the expression increased under adipogenic culture conditions. This might indicate an interaction between the osteogenic and adipogenic differentiation cascade.Furthermore the ambivalent function of BMP-2 during the differentiation process of mesenchymal stromal cells became explicit. In undifferentiated cells of the fracture group the expression of BMP-2 was significantly decreased, which indicates a diminished osteogenic differentiation capacity of these cells. Because of an increased expression of this gene during the adipogenic differentiation, this study could also show the link between BMP-2 and the differentiation of stromal cells into adipocytes. Moreover, a positive correlation between BMP-2 and PPARgamma could be determined. The investigation of the PPARgamma expression was an important part of this study, because many authors claim that an adipogenic determination of stromal cells might be a part of the pathogenesis of osteoporosis. This adipogenic determination could only in part be comprehended in this study. There was neither difference between the osteoporotic and the osteoarthritic group in the expression of PPARgamma in undifferentiated cells, nor in cells that were cultured in adipogenic medium. However cells from fracture patients showed an increased expression when they were cultured under osteogenic conditions. In view of the underlying mechanisms of the emergence of osteoporosis, the most important finding of this study was that adipogenic differentiation of stromal cells led to a high significant increase of RANKL expression. This indicates that the increasing adiposity of bone marrow in elderly persons might actively promote bone resorption. Moreover a positive correlation between RANKL and Runx-2 in cells from fracture patients cultured in osteogenic medium was detected. This leads to the assumption, that osteogenic differentiated cells of osteoporosis patients might degrade bone tissue.The role of OPG as a contrary regulated antagonist of RANKL could be proofed in this study.
Keywords: ddc:630