Entwicklung und Anwendung eines Enzymimmuntests zum Nachweis des Mykotoxins Tenuazonsäure in Lebensmitteln - Groß, Madeleine; Justus Liebig University Giessen (My University, 2012)
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Anwendung eines enzymimmunologischen Verfahrens zum quantitativen Nachweis von Tenuazonsäure (TeA), einem Mykotoxin der Alternaria-Gruppe, in Apfel- und Tomatenprodukten.Zur Herstellung eines immunogenen Toxin-Protein-Konjugates und eines enzymmarkierten Antigens wurde TeA zunächst mittels Bernsteinsäureanhydrid derivatisiert. Für die Kopplung dieses Toxinderivates an Trägerprotein (Hämocyanin, KLH) zur Immunogensynthese sowie an das Enzym Meerettichperoxidase (HRP) zur Herstellung eines markierten Antigens wurde eine aktive Estermethode verwendet. Nach Immunisierung von Kaninchen mit TeA-KLH konnten Antikörper gegen TeA gewonnen werden. Die Immunantwort wurde mittels eines kompetitiven direkten Enzymimmuntest (Doppelantikörpertechnik unter Verwendung von Anti-Kaninchen-IgG) untersucht. Die Spezifität wurde durch Vergleich von TeA-Standardlösung mit anderen relevanten Substanzen getestet. Das TeA-KLH-Konjugat induzierte eine TeA-spezifische Immunantwort. Vier Wochen nach Grundimmunisierung konnten bei drei von vier Tieren Antikörpertiter nachgewiesen werden. Das Antiserum eines Tieres (K1) erwies sich nach der Restimulation als ausreichend empfindlich. Ein kompetitiver direkter Enzymimmuntest (TeA-Enzymimmuntest) wurde entwickelt unter Verwendung von Anti-TeA-Antiserum und TeA-HRP-Konjugat. Der TeA-Enzymimmuntest war mäßig empfindlich für freie TeA (50%-Inhibitionsdosis: 223 ng/ml), aber sehr empfindlich für acetylierte TeA (50%-Inhibitionsdosis 23,3 ng/ml; Nachweisgrenze (70%-Inhibitionsdosis): 5 ng/ml). Die Spezifität dieses direkten, simultanen Nachweisverfahrens für Tenuazonsäure wurde durch Einsatz anderer Toxine aus der Alternaria-Gruppe überprüft. Kreuzreaktionen mit anderen Alternaria-Toxinen (AOH, AME und ALT) lagen bei <1%. Dieses Ergebnis war nicht überraschend, da die chemische Struktur von TeA keinerlei Ähnlichkeit mit der der anderen Toxine der Alternaria-Gruppe aufweist. Aufgrund der circa zehnfach höheren Empfindlichkeit des Testsystems für TeA-Acetat als für freie TeA wurde ein Protokoll für die Probenaufbereitung erstellt, das die Acetylierung von eventuell in der Probe vorhandenem TeA-Toxin einschloss. Für die Überprüfung der Anwendbarkeit dieses Tests wurden Apfel- und Tomatenproben verwendet. Zum Nachweis von TeA in Apfel- und Tomatenproben erfolgte eine Extraktion nach Aufreinigung mittels Flüssig-Flüssigverteilungschromatographie mit Ethylacetat entweder bei der unverdünnten Probe (Apfelsaft, Tomatensaft) oder bei der mit A. dest. verdünnten Probe (Tomatenketchup, Tomatenmark). Nach Verdampfen erfolgte die einstündige Acetylierung der Probe mit anschließender Verdünnung mit PBS 1:20. Weitere Verdünnungen wurden mit 5% Acetonitril/PBS angefertigt. Die Nachweisgrenzen für TeA in unterschiedlichen Probenmatrices lagen zumeist bei 25-50 ng/g, für Tomatenmark bei ~ 150 ng/g. Die Wiederfindungsraten in unterschiedlichen Probenmatrices waren zumeist zufriedenstellend (34-136%). Eine Probe von sieben untersuchten Apfelsäften enthielt TeA in einer Konzentration von 58 ng/ml. Drei von fünfzehn untersuchten Tomatensäften enthielten TeA in einem Konzentrationsbereich von 61-227 ng/ml, und zwei von achtzehn untersuchten Tomatenketchupproben enthielten TeA in Konzentrationen von 55,2 ng/g und 67,3 ng/g. In keiner der zehn untersuchten Tomatenmarkproben konnte TeA nachgewiesen werden.In einer Untersuchung zum Vorkommen von TeA in natürlich mit Schwärzepilzen kontaminierten Tomaten aus dem deutschen Einzelhandel konnte gezeigt werden, dass nach längerer Lagerung hohe Gehalte (max. 480 ng/g) an TeA im Fruchtfleisch erreicht wurden. Mikroskopisch wurden in einigen dieser Proben Alternaria spp. festgestellt, im Enzymimmuntest konnte in diesen Proben TeA nachgewiesen werden. Bei einer Untersuchung des Vorkommens von Tenuazonsäure bei verschiedenen Pilzspezies wurden unterschiedliche Schimmelpilze (Penicillium sp., Aspergillus spp., Alternaria sp.) aus der Stammsammlung des Instituts geprüft. Lediglich im Mycel von Alternaria spp. wurde TeA nachgewiesen, hier allerdings in extrem hohen Konzentrationen (130.000 ng/g).

Enzyme Immunoassay for tenuazonic acid (TeA) in apple and tomato productsThe present study describes the development and application of an enzyme immunoassay for the detection of tenuazonic acid (TeA), a mycotoxin of the Alternaria group, in apple and tomato products.TeA was derivatized with succinic anhydride and conjugated to the proteins keyhole limpet hemocyanin (KLH) and bovine serum albumin (BSA) and to the enzyme horseradish peroxidase (HRP) via an activated ester method.The KLH conjugate was used to produce polyclonal antibodies in rabbits. The immune response was screened in a competitive EIA using Anti-rabbit IgG in a double antibody solid phase system. The antibody specificity was determined by competitive binding inhibition of several other compounds compared with TeA standard solution. The TeA-KLH conjugate demonstrated an immunogenic activity. Four weeks after the first immunisation, antibody titers could be detected in three of four rabbits but only those of one rabbit were sufficiently specific after the first restimulation. The antisera of the other rabbits were not sufficiently sensitive for the development of an enzyme immunoassay. A competitive direct EIA was established with Anti-TeA antiserum and TeA-HRP conjugate.The enzyme immunoassay was moderately sensitive for TeA (IC50 of the TeA standard curve: 223 ng/mL), but was very sensitive for acetyl-TeA (IC50: 23.3 ng/mL; detection limit 5 ng/mL). Cross-reactivities with other Alternaria mycotoxins (AOH, AME, ALT) were < 1%. This was not surprising, since the chemical structure of TeA has no similarities with the other Alternaria toxins. Therefore a sample preparation protocol was established which includes an acetylation step of TeA. For application studies apple and tomato products were examined. For the assessment of TeA in apple and tomato products, an extraction was used with a clean up step liquid-liquid partition with ethyl acetate either in the the undiluted sample (apple juice, tomato juice) or in the sample diluted with distilled water. (tomato ketchup, tomato paste). Detection limits for tenuazonic in different matrices were from 25-50 ng/g (apple juice: 25 ng/mL; tomato juice: 50 ng/mL; tomato ketchup: 40 ng/g), and tomato paste ~ 150 ng/g, respectively. The recoveries in various matrices were mostly satisfactory (34-136%). One of seven analyzed samples of commercial apple juices contained TeA, at a level of 58 mg/mL. Three out of 15 tomato juice samples contained TeA in a concentration range of 61-227 ng/mL, and two out of 18 tomato ketchup samples contained TeA at levels 55.2 ng/g and 67.3 ng/g. In the tomato paste samples, no TeA could be detected by EIA.For the assessment of TeA in naturally contaminated, mouldy tomatoes from the German market it was shown that high levels of TeA (up to 480 ng/g) could be present in the pulp. In the microscopic examination, Alternaria spores could be detected in some of the samples, in all of these samples TeA was detected.For a preliminary assessment of TeA in different fungal genera, mycelium of fungal species (Penicillium sp., Aspergillus spp., and Alternaria sp.) was analysed by enzyme immunoassay. TeA was only found in the mycelium extract of the Alternaria spp..
Keywords: ddc:630