Untersuchungen des Einflusses von Inhibitoren der Angiogenese und ionisierender Bestrahlung auf das Wachstumsverhalten solider Tumoren in vivo - Zieher, Heike; Justus Liebig University Giessen (My University, 2007)
Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Gefäßen, stellt die Voraussetzung für das Wachstum und die Metastasierung solider Tumoren dar. Aufgrund der komplexen Gegebenheiten bei der Blutgefäßbildung erscheint es nahe liegend, dass durch eine antiangiogene Therapie, die gleichzeitig an verschiedenen Stellen der angiogenen Signalketten angreift, die therapeutische Effizienz gesteigert werden kann. Die Erkenntnis, dass eine Bestrahlung selbst zu einer Intensivierung angiogener Folgereaktionen und damit zur Strahlenresistenz beitragen kann, begründet gleichermaßen die Hoffnung, dass durch Unterbrechung dieser Mechanismen die Radioresistenz von Tumoren verringert werden könnte. Unter Berücksichtigung dieser Aspekte wurden im Rahmen dieser Arbeit die Einflüsse von drei verschiedenen kombinierten Behandlungskonzepten mit Angiogenese-Inhibitoren (AI) auf das Wachstumsverhalten von soliden Tumoren an zwei subkutanen (ektopen) humanen Xenograft-Tumormodellen auf Nacktmäusen untersucht. Die Tumorzellen wurden nach in-vitro-Anzüchtung als Suspension subkutan am linken Oberschenkel der Tiere verabreicht. Tumortragende Tiere wurden randomisiert den Versuchsgruppen zugeteilt. Mit der Behandlung wurde bei gemessenen Tumorvolumina von 75 - 200 mm³ begonnen. Endostatin wurde 14 Tage lang, alle weiteren Substanzen jeweils bis zum Ende der Beobachtungen subkutan verabreicht. Die Tiere der Kontrollgruppen wurden entsprechend mit den Trägerlösungen, jeweils ohne Wirkstoff, behandelt. Die Bestrahlung der Tiere der Bestrahlungsgruppen erfolgte lokal mit einer 60Cobalt-Strahlenquelle (Siemens Gammatron S). Zur Berechnung der Tumorvolumina wurden Länge, Breite und Höhe der Tumoren gemessen. Ergänzend zur Messung der Tumorgrößen wurden aus jeder Gruppe Tumorgewebe im jeweiligen Versuchszeitraum histologisch bzw. immunhistochemisch untersucht. Zunächst wurde der Einfluss der kombinierten Behandlung mit Endostatin, einem direkten AI, und einem selektiven VEGFR2-Inhibitor (SU5416), einem sogenannten indirekten AI, am PC3-Prostatakarzinom-Xenograft untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die bimodale Therapie verglichen mit den jeweils einzeln eingesetzten Substanzen zu einer deutlichen verstärkten Hemmung des Tumorwachstums bis hin zur dauerhaften Rückbildung führte. Bei der histologischen Untersuchung waren bereits zu einem frühen Zeitpunkt (Tag 10 der Behandlungen) starke Veränderungen bei den Tumorgeweben der Behandlungsgruppen ersichtlich. Die Ergebnisse berechtigen zu der Annahme, dass die therapeutische Effizienz einer Behandlung mit der bereits als Monotherapeutikum in klinischer Testung befindlichen Substanz Endostatin durch Gabe eines weiteren AI, der, wie hier verwendet, die Signalkette des Wachstumsfaktors VEGF blockiert, deutlich gesteigert werden könnte. Des weiteren beschäftigte sich diese Arbeit mit der Frage, inwieweit eine gleichzeitige Blockade mehrerer Wachstumsfaktoren durch die Wirkstoffe SU5416 und SU6668, einem RTK-Inhibitor von PDGF, bFGF und VEGF die Therapieeffekte von ionisierender Bestrahlung bei PC3-Tumoren weiter steigern kann. Die zuvor bereits bei unterschiedlichen in-vivo-Modellen nachgewiesenen stärkeren antiangiogenen und antitumoralen Effekte durch den kombinierten Einsatz der Substanzen SU5416 und SU6668 zeigten sich auch bei diesen Untersuchungen. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass sich die günstigen Effekte einer Kombination von Radiotherapie bei gleichzeitiger Rezeptor-Tyrosinkinase-Blockade deutlich steigern lassen und die Ergebnisse somit im Einklang mit der bereits nachgewiesenen Radiosensibilisierung durch einzelne RTK-Inhibitoren stehen. Dabei erzielte die Hemmung eines breiteren Spektrums an Tyrosinkinasen (durch SU6668) bereits die stärkste Wachstumshemmung bis hin zur Tumorkontrolle bei einzelnen Tieren, bei der die Tumoren im Beobachtungszeitraum im Mittel lediglich das zweifache ihres Anfangsvolumens erreichten. Interessanterweise ergab die Analyse der Gefäßdichte und Tumorzellproliferation der Tumorgewebe, dass die antiangiogenen und antitumoralen Effekte durch die Dreifachbehandlung weiter verstärkt wurden. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit bestand in der Untersuchung von Effekten einer zusätzlich zur Bestrahlung vorgenommenen Integrin-Hemmung durch den kleinmolekularen Antagonisten der & #945;v-Integrine, S247, auf das Tumorwachstum. Diese Kombination wurde am PC3-Tumormodell und anschließend an einem weiteren Tumor-Xenograft untersucht, dem Epidermoid-Karzinom A431. Es zeigte sich bei beiden Modellen, dass der kombinierte Einsatz des Angiogenese-Inhibitors und Radiotherapie die Hemmung des Tumorwachstums gegenüber den jeweiligen Monotherapien deutlich verstärkte. Die Wachstumsverzögerung bei PC3 war derart ausgeprägt, dass die Tumoren im Schnitt das zweifache ihres Anfangsvolumens im Versuchszeitraum nicht erreichten und vereinzelt eine Rückbildung bzw. Tumorkontrolle beobachtet wurde. Bei den PC3-Tumorhistologien waren die Tumorgefäßzahl und Tumorzellproliferation bei der Kombinationsgruppe signifikant weiter verringert. Anhand der Untersuchung von A431-Tumorgeweben konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit S247 zu einer reduzierten Phosphorylierung von Akt und einer gesteigerten Endothelzell-Apoptose führte, insbesondere bei den bestrahlten Tumoren. Somit hatte die antiangiogene Therapie mit S247 kombiniert mit lokaler, niedrig dosierter fraktionierter Bestrahlung einen bemerkenswerten Erfolg auf Wachstum des PC3 wie auch auf den sehr schnell wachsenden Tumor A431.Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten kombinierten Behandlungsprotokolle stellen somit aussichtsreiche Konzepte für einen klinischen Einsatz bei der Behandlung von Tumorerkrankungen dar.

Angiogenesis, the formation of new vessels from pre-existing vessels, represents the precondition for growth and metastasizing of solid tumors. Regarding the complex mechanisms of angiogenesis it seems quite obvious that treatment concepts simultaneously affecting different locations of angiogenic signaling may enhance therapeutical efficacy. Radiation itself contributes to an increase of angiogenic effects and therefore promotes radioresistance. Likewise there exists justified hope that interrupting these mechanisms may decrease radioresistance of tumors.Regarding these aspects the effects of three different combined treatment concepts including angiogenesis inhibitors have been studied in the course of this thesis. In this context, two different solid xenograft tumor models subcutanously growing in nude mice were used.After propagating in vitro, tumor cells were resuspended and injected subcutanously into the left hind limb of the animals. Tumor bearing mice were randomized into therapy groups. Treatment was started when tumors had reached volumes between 75 and 200 mm³. All substances were administered subcutanously; Endostatin for 14 days, all other substances until the end of observation. Animals from control groups were given carriers only (without active agents) following exactly the schedule of the treated groups. Local radiation was applied by a Siemens Gamatron S (60Cobalt). To calculate tumor volumes, length, width and depth of the tumors were determined three times weekly by direct measurement with calipers. Accordingly tumors of each group were taken for histological and immunohistochemical examination during the period of investigation. Initially, the combined effect of the direct angiogenesis inhibitor endostatin with the indirect anti-angiogenic compound SU5416 (selective VEGFR2 RTK-inhibitor) was investigated on the PC3 xenograft. The combination of SU5416 and low-dose endostatin reduced tumor growth more effectively in combination in contrast to their single application respectively. In some animals tumor regression was induced. Additionally, early histology and immuno-histochemistry of PC3 tumors showed major changes in tissues from treated groups. Summarizing, present data suggest that combining endostatin with other antiangiogenic compounds blocking specific pathways, especially the VEGF pathway, may achieve markedly increased therapeutic effectiveness. In addition, the concept of inhibiting several growth factors at a time was examined on the PC3 xenograft, using the VEGFR2 inhibitor SU5416 and SU6668, an inhibitor of PDGFR, bFGF and VEGF. Also, the concomitant therapeutical effects of radiotherapy were tested. It could be shown that the recently proposed concept of inhibiting both, VEGF and PDGF, resulted in enhanced antiangiogenic and antitumoral effects. Radiation markedly increased tumor growth delay in all kinase inhibitor groups, ongoing with pre-existing results of radiosensitizing by inhibitors of receptor tyrosine kinases. Interestingly, the combination of radiotherapy with the broad spectrum RTK inhibitor SU6668 alone already induced tumor control and tumors did not reach two-fold of their initial tumor volume. A further increased effectiveness due to additional SU5416 treatment could not be detected within the experimental design. Data on CD31 vascular counts as well as the tumor proliferation (Ki67 staining) demonstrate that the triple combination had the highest antiangiogenic and antitumor activity among the schedules tested. Moreover, this thesis investigated the effects of combination of radiation with concurrent administration of S247, a small molecular antagonist of the αv-integrins, on the growth of solid tumors. This combination was examined on both the human prostate carcinoma PC3 and the human epidermoid carcinoma A431. In both models it could be demonstrated that the combination of radiation and S247 administration induced significant delays in tumor growth in contrast to that produced by either therapy alone. During PC3 test series, tumors of the combination group did not reach a two-fold of their initial tumor volume during the period of investigation and in some animals tumor control or regression was mediated. Accordingly, immuno-histochemistry of PC3 tumors showed significantly reduced number of vessels and proliferating tumor cells in the combination group. In A431 tumors, treatment with S247 in particular in the irradiated group, resulted in an increased endothelial cell apoptosis and reduced phosphorylation of Akt. Consequently antiangiogenic therapy with S247 combined with local low-dose fractionated irradiation produced an remarkable inhibitory effect on the growth of PC3 as well as on the fast growing A431 tumor. Therefore the combined protocols of treatment investigated in the course of this thesis represent promising concepts for local cancer therapy in the future.
Keywords: ddc:630