Das ligninolytische System von Pleurotus sapidus: Transkriptomanalyse und heterologe Expression einer Arylalkoholoxidase - Galperin, Ilya; Justus Liebig University Giessen (My University, 2018)
Die meisten Speisepilze gehören zu den Basidiomyceten. Neben ihrer Rolle als Nahrungsquelle haben sie auch ein erhebliches biotechnologisches Potential. Sie sind mit ihren Enzymen in der Lage durch Weiß- und Braunfäule Lignin und Cellulose im toten Holz zu zersetzen. Einige dieser Enzyme werden bereits industriell genutzt und die Pilze sind deswegen von großem wirtschaftlichen und wissenschaftlichen Interesse im Bereich der nachhaltigen Biotechnologie und der Nutzung erneuerbarer Ressourcen.In dieser Studie wurde das Transkriptom des mit dem Austernseitling Pleurotus ostreatus verwandten Weißfäulepilzes Pleurotus sapidus mittels RNA-Sequenzierung analysiert. Der Pilz wurde dafür in Submers- und Emerskulturen mit Rapsstroh als Kohlenstoffquelle kultiviert und an vier Zeitpunkten untersucht. Die Sequenzierung ergab 20,58 Millionen paired-end reads (2x150 bp lang). Die Transkripte wurden de novo assembliert und mittels des Genoms des verwandten P. ostreatus annotiert. Von 30.680 Contigs wurden 4.551 an unterschiedlichen Zeitpunkten der Kultivierung differentiell transkribiert. Der Schwerpunkt der Analyse lag dabei auf Enzymen, wie Peroxidasen, Laccasen und H2O2-produzierenden Enzymen, die am Ligninabbau beteiligt sind. Die Änderungen in der Transkription entsprechender Gene wurden bei einigen Genen zusätzlich mittels RT-qPCR validiert. Übereinstimmungen zwischen RNA-Seq und RT-qPCR Ergebnissen wurden vor allem bei stärker transkribierten Genen festgestellt. Zusätzlich wurden mehrere Enzymaktivitätsassays durchgeführt. Die am stärksten transkribierten Peroxidasen waren vp2, vp3 und mnp3, die vor allem in Emerskulturen zusammen mit H2O2-produzierenden Enzymen höhere Transkriptionsraten aufwiesen.Neben der Transkriptomanalyse von P. sapidus wurde der Pilz Coprinopsis cinerea mit dem Gen einer Arylalkoholoxidase (AAO) aus P. sapidus transformiert. Bei AAO handelt es sich um ein Enzym, das H2O2 generiert, das für die Reaktion von Peroxidasen benötigt wird. In P. sapidus wurde relativ wenig natives AAO exprimiert. Für die Transformation wurde ein Vektor mit gpdII-Promotor und aao samt nativer Signalpeptidsequenz mittels homologer Rekombination in Saccharomyces cerevisiae erzeugt. Die AAO wurde in C. cinerea erfolgreich heterolog exprimiert und sekretiert. Es handelte sich dabei um die erste erfolgreiche rekombinante Produktion einer AAO in einem Basidiomyceten bzw. um die erste heterologe Expression einer Oxidase in C. cinerea. Das Enzym wurde gereinigt, und mittels SDS-PAGE, Western Blot und Peptidmassenfingerprint untersucht. Die Glykosylierung, die 11% des Molekulargewichtes betrug, entsprach der Glykosylierung nativer AAOs verwandter Pilze. Die AAO wurde biochemisch charakterisiert indem die Kinetik des Enzyms nach Michaelis-Menten, der isoelektrische Punkt, sowie pH und Temperaturoptima bestimmt wurden. pH-Optimum lag bei pH 5 und pI bei 4,2. Die Enzymkinetik ähnelte der von AAOs aus verwandten Pilzen. Die AAO aus P. sapidus wurde in C. cinerea korrekt prozessiert. In einem Zwei-Enzym-Assay wurde eine DyP-Typ Peroxidase von AAO effektiv mit H2O2 versorgt. Um die Ausbeute an AAO zu erhöhen, wurden verschiedene Kulturmedien und Kultivierungsbedingungen getestet. Mit dem Einsatz des modifizierten Kjalke-Mediums konnte die Enzymaktivität im Kulturüberstand um das Fünffache gesteigert werden. Die Kultivierung im akustischen Resonanzmischer brachte dagegen keine Vorteile im Vergleich zur Kultivierung in Schüttelkolben oder Bioreaktor. Insgesamt erwies sich C. cinerea als eine vielversprechende Plattform für die heterologe Expression pilzlicher Enzyme.

Almost all edible fungi belong taxonomically to basidiomycetes. Besides their value as a food source, they also have a considerable biotechnological potential. They are able to degrade lignin and cellulose in dead wood with their enzymes during processes known as white or brown rot. Some of these enzymes are already used in the industry, but most of this fungal bioresource is still unknown and, thus, of great scientific and economic interest in the area of sustainable biotechnology and renewable resources.In this study, the transcriptome of Pleurotus sapidus, a mushroom related to the oyster mushroom Pleurotus ostreatus, was analyzed by means of RNA sequencing. The fungus was cultivated in liquid and solid-state cultures with rapeseed straw as a carbon source. The sequencing resulted in 20.58 Million 150 bp paired-end reads. The transcripts were de novo assembled and annotated with the genome of related P. ostreatus. Out of 30,680 contigs 4,551 showed an altered transcription pattern during different time-points of cultivation. The main emphasis of the analysis were enzymes, such as peroxidases, laccases and H2O2-generating enzymes, that are involved in degradation of lignin. The changes in transcription of correspondent genes was additionally validated by means of RT-qPCR for some of the genes detected in the transcriptome. Highly transcribed genes showed similar results in RNA-Seq and RT-qPCR experiments. Whereas the comparability of RNA-Seq and RT-qPCR data was reduced or not possible for genes with a low transcription. Additionally, several enzyme assays were carried out. The highest transcribed peroxidases were vp2, vp3 and mnp3, especially in solid-state cultures, where they had high transcription rates, together which H2O2-generating enzymes.Besides the analysis of the transcriptome of P. sapidus, the fungus C. cinerea was transformed with a gene coding for an aryl-alcohol oxidase (AAO) of P. sapidus. AAO is an enzyme that produces H2O2 needed for the reaction of peroxidases. P. ostreatus expressed a relatively low amount of native AAO. For the transformation, a vector containing gpdII-Promotor and aao with native signal peptide sequence was created by means of homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae. The recombinant AAO was successfully expressed and secreted by C. cinerea. It was the first recombinant production of an AAO in a basidiomycete or an oxidase in C. cinerea. The enzyme was purified and examined via SDS-PAGE, Western Blot and peptide mass fingerprinting. The glycosylation of 11% of the molecular weight corresponded with the glycosylation of native AAO of related mushrooms. AAO was characterized by determination of Michaelis-Menten kinetics with three substrates, isoelectric point, as well as the pH and temperature optima. The pH optimum was pH 5 and pI was 4.2. The enzyme kinetic was similar to kinetics of AAOs from related fungi. AAO was processed correctly in C. cinerea. In a two-enzyme assay, the AAO effectively supplied a dye- decolourising peroxidase with H2O2. Different culture media and conditions were evaluated in order to increase the AAO yield in liquid culture of the AAO transformant. The usage of modified Kjalke-Medium lead to a fivefold increase of enzyme activity in supernatant. Cultivation in an acoustic resonance mixing system was not advantageous compared to cultivations in shake flasks or in stirred bioreactors. In total, C. cinerea proved itself as a promising platform for heterologous expression of fungal enzymes.
The ligninolytic system of Pleurotus sapidus: Transcriptome analysis and heterologous expression of an aryl-alcohol oxidase
Keywords: Pleurotus sapidus; Ligninolyse; Arylalkoholoxidase; Transkriptom; Pleurotus sapidus; ligninolyis; aryl-alcohol oxidase; transcriptome; ddc:570