Role of Bcl-xL in HGF-elicited epithelial protection in idiopathic pulmonary fibrosis - Skwarna, Sylwia; Justus Liebig University Giessen (My University, 2014)
Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic and progressive diffuse parenchymal lung disease of unknown etiology (Ley et al., 2011). Existing evidence strongly suggests that the alveolar epithelial cell (AEC) is the key player in the pathogenesis of IPF. It is believed that repetitive cycles of epithelial cell injury, followed by impaired wound healing, lead to an excessive apoptosis of AECs, accompanied by aberrant activation of fibroblasts/myofibroblasts, deregulated remodeling and, finally, irreversible restructuring of the lung parenchyma (Selman et al., 2002, Zoz et al., 2001). Hepatocyte growth factor (HGF) is a pleiotropic cytokine playing a major role in cellular repair processes, ensuring restoration of epithelial homeostasis in the damaged organ. Exogenous administration of HGF has been reported beneficial in experimental models of various organ fibrosis including the lung. Bcl-xL is an anti-apoptotic member of Bcl-2 family which consists of highly conserved proteins involved in the mitochondrial control of apoptosis. Since HGF signaling via c-Met receptor has been proposed to regulate the expression of Bcl-2 family members, the present study was performed to evaluate the potential role of Bcl-xL in HGF-mediated epithelial protection in IPF. We therefore aimed to characterize Bcl-xL expression and its cellular localization in lung tissues of IPF patients in comparison to donor lung tissues, to investigate if HGF mediates pro-survival effects on alveolar epithelial cells regardless of the kind of pro apoptotic stimulus and to assess the potential role of Bcl-xL in this context. Employing tissues from human IPF and donor lung resections, we observed that Bcl-xL protein was highly expressed in hyperplastic AECII found in regions of dense fibrosis in IPF. Donor lung tissues revealed a much weaker signal for Bcl-xL in the alveolar epithelium. These findings were confirmed by Western blot analysis which revealed a significant increase in the total Bcl-xL amount in IPF lung versus donor lung homogenates. Furthermore, staining for Bcl-xL in AECII in still regular imposing areas was less prominent than in hyperplastic AECII present in fibroblastic regions.In vitro studies were performed on mouse (MLE12, MLE15) and rat (RLE-6TN) alveolar epithelial cell lines. Since it has been reported that human IPF is characterized by permanent oxidative stress, enhanced activation of ER stress and up-regulation of Fas ligand (FasL), we chose hydrogen peroxide, thapsigargin and FasL as apoptosis-inducing factors in this study. We observed that simultaneous treatment with HGF and hydrogen peroxide or thapsigargin resulted in an improved survival of alveolar epithelial cells. In both cases, the HGF-mediated anti-apoptotic activity was associated with increased Bcl-xL expression and the beneficial effect of HGF could be abolished by using a c-Met specific inhibitor prior to HGF incubation. The siRNA-mediated knock-down of Bcl-xL caused an increased susceptibility of the epithelial cells to injury. However, although less efficient, HGF treatment still remained profitable and resulted in improved cell survival despite of the low level of Bcl-xL. Interestingly, FasL-triggered activation of Caspase 3 did not affect the expression level of Bcl-xL. In line with these results, we did not observe a beneficial effect of HGF on FasL-induced apoptotic cells. Altogether, our findings demonstrate that i) Bcl-xL is up-regulated in human IPF, predominantly in AECII and especially in areas with dense fibrosis, ii) knock down of Bcl-xL makes alveolar epithelial cells much more susceptible to injury and cell death, iii) Bcl-xL accounts at least in part for the HGF-elicited epithelial protection against oxidative as well as ER stress. Bcl-xL therefore offers as interesting candidate for epithelial-protective therapies in IPF and other forms of lung fibrosis associated with epithelial apoptosis.

Lungenerkrankung (DPLD), deren Ursache noch nicht vollständig bekannt ist (Ley et al., 2011). Es gibt vermehrte Hinweise, dass Alveolarepithel Typ II Zellen (AECII) eine zentrale Rolle bei der Pathogenese der IPF spielen. Man nimmt an, dass repetitive Schädigungen epithelialer Zellen, gefolgt von einer abnormalen Wundheilungsreaktion Die Idiopathische Pulmonale Fibrose (IPF) ist eine chronische, progressiv verlaufende Diffus Parenchymatöse zu einer exzessiven Apoptose der AECII führen, die zusammen mit der Aktivierung von Fibroblasten/Myofibroblasten und einem dysregulierten Remodeling schließlich in einem irreversiblen Umbau des Lungenparenchyms münden (Selman et al., 2002, Zoz et al., 2001). Der Hepatozytenwachstumsfaktor (Hepatocyte Growth Factor, HGF) ist ein Zytokin mit pleiotropen Funktionen, der wesentlich für zelluläre Reparaturprozesse verantwortlich ist und in der Lage ist die epitheliale Homöostase in geschädigten Organen wiederherzustellen. Die exogene Verabreichung von HGF hat sich in tierexperimentellen Modellen verschiedener Organfibrosen, einschließlich der Lunge, als therapeutisch wirksam erwiesen. Bcl-xL ist ein anti-apoptotisch wirksamer Vertreter der Bcl-2 Familie, die aus hochkonservierten Proteinen besteht und an der mitochondrialen Kontrolle der Apoptose beteiligt ist. Da in früheren Studien gezeigt werden konnte, dass HGF über seinen Rezeptor cMet die Expression von Mitgliedern der Bcl-2 Proteinfamilie zu regulieren vermag, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit Bcl-xL an der HGF-vermittelten Protektion epithelialer Zellen bei der IPF beteiligt ist. Ziel war es die Bcl-xL Expression und deren zelluläre Lokalisation in IPF-Lungen im Vergleich zu gesunden Spenderlungen zu charakterisieren, und zu untersuchen, ob die HGF-vermittelten Epithelzell-protektiven Effekte unabhängig von der Art des apoptotischen Stimulus sind und welche Rolle Bcl-xL in diesem Zusammenhang spielt. Im Vergleich zu nicht utilisierten Donorlungen konnte im Lungengewebe von IPF Patienten eine signifikant erhöhte Expression des Bcl-xL Proteins, vor allem in hyperplastischen AECII und Bereichen mit dichter Fibrose, nachgewiesen werden. Bcl-xL war ebenfalls in AECII von Donorlungengewebe nachweisbar, wurde dort allerdings deutlich schwächer exprimiert. Diese Befunde wurden durch Western Blot Analysen, die einen signifikanten Anstieg des Bcl-xL im Lungenhomogenat von IPF Lungen versus Donorlungen zeigten, gestützt. In IPF Lungen war in Bereichen mit einer weitgehend normalen Lungenstruktur die immunhistochemische Anfärbung für Bcl-xL in AECII deutlich abgeschwächt, verglichen mit hyperplastische AECII in Bereichen mit einem starken Geweberemodeling.An Maus (MLE12, MLE15) und Ratten (RLE-6TN) Epithelzelllinien wurden in vitro Versuche durchgeführt. Da bei der Pathogenese der IPF oxidativer Stress, Induktion von ER-Stress und eine erhöhte Expression von Fas Ligand (FasL) beschrieben ist, wurden für die Zellkulturversuche Wasserstoffperoxid, Thapsigargin und FasL als Apoptose-indizierende Stimuli eingesetzt. Eine gleichzeitige Behandlung der Zellen mit HGF und Wasserstoffperoxid bzw. HGF und Thapsigargin führte zu einer gesteigerten Überlebensrate der Zellen. In beiden Fällen war parallel zu den HGF-vermittelten anti-apoptotischen Effekten ein Anstieg der Bcl-xL Expression zu beobachten. Der protektive HGF Effekt konnte durch unter Verwendung eines cMet-spezifischen Inhibitors aufgehoben werden. Der siRNA-vermittelte Knockdown von Bcl-xL führte zu einer erhöhten Empfindlichkeit der Epithelzellen gegenüber den schädigenden Agenzien. Eine gleichzeitige Behandlung der Zellen mit HGF erwies sich wenn auch in geringerem Umfang- als zellprotektiv und führte trotz geringerer Bcl-xL Spiegel zu einer verbesserten Überlebensrate der Zellen. Interessanterweise hatte die FasL vermittelte Aktivierung von Caspase 3 keinen Einfluß auf die Bcl-xL Spiegel, und ebenso hatte HGF keinen protektiven Einfluss auf die FasL-induzierte Apoptose von Epithelzellen. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass i) Bcl-xL bei der IPF erhöht ist, vornehmlich in AECII und speziell in Bereichen mit starker Fibrosierungsreaktion, ii) der Knockdown von Bcl-xL Alveolarepithelzellen anfälliger gegenüber einer Schädigung und Apoptoseinduktion macht , iii) Bcl-xL zumindest teilweise für den HGF-vermittelten Schutz von Epithelzellen gegenüber oxidativem Stress und ER-Stress verantwortlich ist. Bcl-xL bietet sich somit als ein potentieller Kandidat für Epithelzell-protektive Therapieregimen bei der IPF und anderen Formen von Lungenfibrose mit erhöhter epithelialer Apoptose an.
Die Rolle von Bcl-xL in der HGF-vermittelten epithelialen Protektion bei idiopatischer pulmonaler Fibrose
Keywords: IPF; HGF; Bcl-xL; apoptosis; ddc:610