Untersuchungen zur Wirkung von Shigatoxin 1 von Escherichia coli auf Zellen der unspezifischen Immunabwehr bei Rind, Schaf und Ziege - Eisenberg, Tobias; Justus Liebig University Giessen (My University, 2003)
Da bislang nur Hinweise für eine Beeinträchtigung des spezifischen Immunsystems während der STEC-Infektion des Rindes vorlagen, sollte in dieser Arbeit geklärt werden, ob auch die zum unspezifischen Immunsystem gehörenden Granulozyten verschiedener Wiederkäuerspezies Zielzellen für Shigatoxine (Stx) darstellen. Im Einzelnen wurde dazu mittels Durchflusszytometrie untersucht, ob bovine, ovine und caprine Granulozyten über einen Stx-Rezeptor verfügen und die für die Rezeptorbindung verantwortliche, rekombinante B-Untereinheit (rStxB1) binden können. Anschließend wurde der Frage nachgegangen, ob das aufgereinigte Stx1-Holotoxin und die rStxB1 bei bovinen und ovinen Granulozyten auf direktem oder indirektem Wege einen Einfluss auf die Parameter Vitalität, Phagozytoseaktivität, Aktivierbarkeit und Migrationsfähigkeit ausüben können. Rezeptoren vom Gb3/CD77-Typ fanden sich ex vivo</> auf Granulozyten aus dem Blut von Schaf und Ziege. Bindungsstudien mit rStxB1 bestätigten das Vorhandensein eines Stx-Rezeptors auf den Granulozyten der kleinen Wiederkäuer. In Kompetitionsstudien an Schafgranulozyten konnte die Bindung der rStxB1 an Gb3/CD77 mit hoher Affinität gezeigt werden. Schafgranulozyten banden auch das Stx1-Holotoxin. Stx1 führte in vitro bei Schafgranulozyten aus dem Blut zu einer starken Erhöhung des Anteils früh-apoptotischer Zellen. Derselbe Effekt zeigte sich auch bei Granulozyten aus Schafmilch als ein Modell für Zellen nach Transmigration einer Gewebeschicht. Granulozyten aus dem Blut von Schafen zeigten in Anwesenheit von Stx1 eine erhöhte Phagozytoseaktivität. Ferner beeinflussten Stx1 und rStxB1 die Aktivierbarkeit dieser Zellen. Granulozyten aus dem Blut von Rindern exprimierten ex vivo kein Gb3/CD77 und banden auch die rStxB1 nicht. Beim Rind war auch nach Inkulturnahme und Stimulation der Granulozyten mit LPS sowie bei Milchgranulozyten keine Rezeptorexpression oder Bindung der rStxB1 nachweisbar. Auf die Vitalität von Rindergranulozyten hatten Stx1 und rStxB1 keinen Einfluss. Eine toxinspezifische Beeinträchtigung der Zellfunktionen (Phagozytose, Aktivierbarkeit) trat nicht auf. Allerdings zeigten Rindergranulozyten eine reduzierte Migrationsaktivität hin zu Überständen Stx1-behandelter boviner intestinaler Epithelzellen. In Abhängigkeit von der Wirtsspezies stellen die Granulozyten von Schafen somit direkte und die Granulozyten von Rindern indirekte Zielzellen für Shigatoxin dar. Dies macht auch eine Beeinträchtigung des unspezifischen Immunsystems während der STEC-Infektion von Wiederkäuern wahrscheinlich. Im Hinblick auf die Persistenz der STEC-Infektion könnte sich bei Wiederkäuern ein Gleichgewicht zwischen bakteriell freigesetztem Stx und Stx-supprimierter Granulozytenmigration einstellen und eine symptomlose Infektion etablieren. Beim Schaf wäre darüber hinaus denkbar, dass die Granulozyten die Menge an luminalem Toxin vermindern, indem sie freies Stx mit hoher Affinität binden, apoptotisch werden und mit dem Kot ausgeschieden werden. Die Ergebnisse belegen somit erstmals eine wichtige Rolle des unspezifischen Immunsystems bei der STEC-Infektion der Wiederkäuer, zeigen aber auch starke speziesspezifische Unterschiede auf. Dabei finden sich Unterschiede nicht nur in Bezug auf das für einheitlich gehaltene Reservoir Wiederkäuer, sondern auch im Vergleich zu dem von STEC-bedingten Erkrankungen betroffenen Menschen.

Immunomodulation by Shiga toxins (Stxs) is considered to play an important role in the establishment of persistent bovine STEC infections, since it is known that Stx1 impairs cells belonging to the specific immune system in cattle. In order to supplement our understanding of this immunomodulation the present thesis addressed the question, whether granulocytes - as a part of the innate immune system - of different ruminant species represent target cells for the Stxs. Therefore bovine, ovine, and caprine granulocytes were analysed by flow cytometry for the presence of Stx-receptors and for the ability to bind recombinant StxB1-subunit (rStxB1). Subsequent investigations assessed the putative effect either by direct or indirect means - of purified Stx1-holotoxin and rStxB1 on viability, phagocytic and oxdative burst-activity, and migratory capability of the cells. Granulocytes obtained from the peripheral blood of sheep and goats expressed Stx-receptors of the Gb3/CD77-type ex vivo. Binding studies with rStxB1 confirmed the presence of functional Stx-receptors on small ruminants` granulocytes. Competition studies with ovine granulocytes demonstrated high affinity binding of rStxB1 by Gb3/CD77. Ovine granulocytes also bound Stx1-holotoxin. In vitro Stx1 increased the number of ovine blood granulocytes entering a state of early apoptosis. The same effect was caused by Stx1 in granulocytes obtained from sheep`s milk as a model for cells having transmigrated through a tissue-layer. Moreover, Stx1 increased the phagocytic activity of ovine granulocytes and Stx1 as well as rStxB1 altered the oxidative burst activity of these cells. Blood granulocytes of cattle neither expressed Gb3/CD77 nor did they bound rStxB1 ex vivo. Furthermore, analysis of cells stimulated with LPS in vitro as well as analysis of granulocytes from bovine milk failed to detect Stx-receptor expression or the ability of the cells to bind rStxB1. There was no toxin-specific effect on cellular functions (phagocytosis, oxidative burst activity) in bovine granulocytes. Nevertheless, bovine granulocytes exhibited an impaired migratory activity towards supernatants of Stx1-treated bovine intestinal epithelial cells. In conclusion, granulocytes from sheep represent direct target cells while bovine granulocytes represent indirect target cells for Stx1. Both aspects point to an impairment of the innate immune system during ruminant`s STEC-infection. With regard to the persistence of STEC-infection it is thus tempting to conclude that a steady state between Stx1 secreted by the STEC and a Stx-suppressed transmigration of granulocytes finally leads to the establishment of asymptomatic infections. Moreover, granulocytes in sheep probably reduce the amount of toxin in the intestinal lumen by binding free Stx with high affinity, undergoing apoptosis, and being eliminated with the feces. For the first time the results thus stress the role of the innate immune system in ruminant`s STEC-infection but also enlighthen striking species-specific differences. These differences not only occur between ruminant species thus far equally regarded as STEC reservoirs but are also apparent in comparison to man who is threatened by STEC-associated illnesses.
Effects of shiga toxin 1 from Escherichia coli on cells of the innate immune system in cattle, sheep, and goats
Keywords: Shigatoxin; Granulozyten; STEC; Apoptose; Wiederkäuer; shiga toxin; granulocytes; VTEC; apoptosis; ruminant; innate immune system; ddc:630