Untersuchungen des cytoplasmatischen Phytochrom-Signalwegs in Physcomitrella patens durch Charakterisierung von Phytochrom 4 Interaktionspartnern - Ermert, Anna Lena; Justus Liebig University Giessen (My University, 2016)
Phytochrome sind Rotlicht-/Dunkelrotlicht (R/FR)-revertierbare Photorezeptoren, die eine zentrale Rolle in der Licht-regulierten pflanzlichen Entwicklung spielen. Der aktivierte Rezeptor transloziert in den Zellkern, interagiert dort mit diversen Signaltransduktions-Komponenten, was zu differenzieller Genregulation führt. Verschiedene Evidenzen belegen allerdings zweifelsfrei, dass es zusätzlich einen Phytochrom-Signalweg im Cytoplasma gibt. Beispielsweise werden Rotlicht-Phototropismus und -polarotropismus im Laubmoos Physcomitrella patens durch Phytochrom (hauptsächlich phy4) vermittelt, was eine Genregulations-basierte Signaltransduktion ausschließt, da die Richtungsinformation dabei zwangsläufig verloren geht. Das Richtungssignal wird an das Aktin-Cytoskelett weitergeleitet, welches während der Reaktion massiv umorganisiert wird und somit als Effektor der polaren Wachstumsantwort gilt. In einem vorherigen Dissertationsprojekt konnte mittels Yeast-Two-Hybrid (Y2H)- und Split-YFP-Methoden eine R-induzierte bzw. in planta Interaktion von phy4 mit dem Blaulichtrezeptor Phototropin an der Plasmamembran (PM) demonstriert werden. Der gestörte R-Photo- und Polarotropismus einer Phototropin-Triple-Mutante belegt die physiologische Relevanz der Photorezeptor-Co-Aktion. In dieser Arbeit wurde ein ex vivo Co-Immunopräzipitations-Assay etabliert und erfolgreich angewendet, um die Interaktion mit einer unabhängigen Methode zu demonstrieren. Der Fokus der Doktorarbeit lag auf der Identifikation und Charakterisierung von phy4-Interaktionspartnern, die am cytoplasmatischen phy4-Signalweg beteiligt sein könnten. Dazu wurde ein Y2H-cDNA-Library Screen mit photoaktivem Volllängen-Holophytochrom als Bait durchgeführt und in R selektiert, um vorwiegend Pfr-spezifische Interaktoren zu erfassen. 70 von 4 x 105 gescreenten Hefeklonen konnten dabei isoliert und nach Sequenzierung in silico bzgl. funktioneller Domänen und Homologen in anderen Pflanzen analysiert werden. Nach Eliminierung identischer Sequenzen verblieben 60 Kandidaten plus vier Weitere aus einem vorhergehenden Screen, denen auf Basis der in silico Analysen und umfangreicher Literaturrecherche mögliche Funktionen zugeordnet wurden. Etwa zwei Drittel der Kandidaten konnten ausgeschlossen werden, da sie wahrscheinlich Metabolismus-, Transkriptions/Translations-, Stress- oder Phytohormon-assoziierte Funktionen ausüben und daher für cytoplasmatisches Phytochrom-Signalling von geringerer Relevanz sind. Ausnahmen bilden hier der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF-5A) und Elongationsfaktor 1alpha (EF1alpha), die wohl duale Funktionen in Translation und Cytoskelett-Organisation im Cytoplasma haben. Interessanterweise hat ein Drittel der Interaktoren mögliche Funktionen in Signaltransduktion oder posttranslationaler Modifikation, Cytoskelett-Assoziation oder als Membranproteine. Die recht große Gruppe der Signaltransduktions-Proteine ist divers und enthält klassische Signalproteine (z.B. ein Pirin und ein 14-3-3 Protein), Proteine mit Protein-Protein-Interaktionsdomänen (PRL1 mit WD40-Domäne, ein Zinkfinger (ZF)- und ein Kelch-Repeat-Protein) und Enzyme (diverse (Ca2+-abhängige) Ser/Thr-Kinasen, und ein P-Loop-Protein mit Sulfotransferase-Domäne). Insgesamt wurden 19 Kandidaten ausgewählt und zunächst als Volllängen CDS aus Physcomitrella cDNA amplifiziert um saubere Prey-Konstrukte herzustellen. Diese wurden anschließend mit Holo-phy4-Baits in einem semiquantitativem Y2H-Wachstums-Assay kombiniert und in Dunkelheit (D), kontinuierlichem R (Rc) bzw. gepulstem R (Rp) bzw. in Rp + FRp selektiert. Dabei konnten 18 putative Interaktionspartner verifiziert werden. Meist fand R-induziertes oder R-verstärktes und FR-revertierbares Wachstumsverhalten statt, so dass entsprechende Interaktoren als Holophytochrome Interacting Proteins (HIPs) bezeichnet wurden. In planta Expression von HIP-Fluoreszenzprotein-Fusionen und fluoreszenzmikroskopische Untersuchung ohne bzw. mit R-Vorbehandlung zeigte, dass alle analysierten HIPs eine cytoplasmatische und ggf. zusätzlich eine nukleäre Lokalisation aufwiesen. Somit sind diese HIPs vermutlich in diesen Kompartimenten funktional. Es konnte in keinem Fall eine differentielle Lokalisation nach R beobachtet werden. Split-YFP-Analysen in D und R konnten in der Tat 12 HIPs auch in planta als phy4 Interaktoren bestätigen. Die HIP-phy4-Interaktionen fanden in der Regel in Cytoplasma und ggf. zusätzlich im Kern statt, wobei 14-3-3/HIP14, EF1alpha/HIP13 und eIF-5A/HIP12 ein Cytoskelett-ähnliches Interaktionsmuster aufwiesen. Das ZF-Protein (HIP3), eine putative Ser/Thr-Proteinkinase (HIP7) und eine putative Intramembran-Serin-Protease (HIP9) interagierten ausschließlich nach R mit phy4, was für eine Pfr-spezifische Interaktion und ggf. phy4-induzierte Aktivierung sprechen könnte. Zukünftig werden physiologische Untersuchungen von HIP-Knockouts Aufschluss über die physiologische Relevanz der HIPs im Phytochrom-Signaltransduktionsweg geben.
Investigation of phytochrome cytoplasmic signalling in Physcomitrella patens by characterisation of phytochrome 4 interacting partners
Keywords: Phytochrom; Signaltransduktion; Phototropin; Physcomitrella patens; Hefe-Zwei-Hybrid; phytochrome; signal transduction; phototropin; Physcomitrella patens; yeast two-hybrid; ddc:570