Beurteilung des Wachstumsverhaltens von nativen, humanen und porcinen Speicheldrüsenzellen auf einer Matrix aus dezellularisierter, porciner Speicheldrüse - Kolb, Evelyn; Justus Liebig University Giessen (My University, 2017)
Bei Patienten, die wegen eines Tumors von Kopf- und Hals bestrahlt werden, kommt es zu einem irreversiblen Funktionsverlust des Speicheldrüsengewebes. Die daraus resultierende Mundtrockenheit beeinträchtigt die Lebensqualität der Patienten in hohem Maße und führt zu Dysphagie, bakterieller Mundhöhleninfektion, oraler Pilzbesiedelung, Karies und reduziertem Geschmacksempfinden. Bisherige Forschungsbemühungen brachten kein Konzept hervor, welches die postradiogene Mundtrockenheit suffizient reduzieren kann. Eine mögliche Alternative zu den derzeit verfügbaren Behandlungsmethoden bietet das Tissue Engineering. Das Ziel ist die Generierung einer artifiziellen Speicheldrüse, die nach erfolgter Bestrahlung in den menschlichen Organismus implantiert werden kann, um so für die notwendige Speichelproduktion zu sorgen.Es wurden humane Parotiszellen verschiedener Patienten in einer 2-dimensionalen Monokultur herangezüchtet und über mehrere Passagen kultiviert, um sie anschließend zu charakterisieren. Zur Entwicklung einer extrazellulären Matrix für die Besiedelung mit humanen und porcinen Speicheldrüsenzellen wurden porcine Speicheldrüsen mit einem modifizierten Dezellularisierungsprotokoll für porcines Jejunum, entwickelt von der Arbeitsgruppe um Mertsching, behandelt (Mertsching et al., 2009). Nach der Dezellularisierung wurden sie in kleine Stücke geschnitten. Um verschiedene Einflussfaktoren für die Adhärenz der Zellen auf der Matrix zu verbessern, erfolgten unterschiedlich lange Waschungen der Matrices mit PBS und Vorbehandlungen mit verschiedenen Substanzen vor der Besiedelung. Die Besiedelung mit humanen und porcinen Speicheldrüsenzellen erfolgte mit unterschiedlichen Zellzahlen und Inkubationszeiten. Die Frage, ob die humanen Parotiszellen über mehrere Passagen in einer 2-dimensionalen Monokultur in vitro ihre charakteristischen Eigenschaften beibehalten, kann wie folgt beantwortet werden: Die Vitalität und das Wachstumsverhalten der humanen Parotiszellen wurden durch die Kultivierungsmaßnahmen in der 2-dimensionalen Monokultur über die Passagen nicht verringert. Auch ihre charakteristische Eigenschaft, alpha-Amylase zu bilden, blieb während der Passagen erhalten und wurde durch histologische Färbungen und auf RNA-Ebene nachgewiesen. Aquaporin 5-Wasserkanäle wurden jedoch nicht ausgebildet. Zu der Frage, wie die humanen Parotiszellen die dezellularisierte, porcine Speicheldrüse als Matrix annehmen, wurden abhängig vom Besiedelungsprotokoll verschiedene Ergebnisse erzielt. Bei den ersten Besiedelungsversuchen wurden auf den Raster-elektronenmikroskopieaufnahmen und histologischen Schnitten der Konstrukte keine Zellen auf der Oberfläche gefunden. Auch die Zellen auf dem Wellboden, die nicht an der Matrix adhärierten, waren größtenteils avital, was durch FDA/EB-Vitalfärbungen bestätigt wurde. Durch den Gallensäuretest wurde bewiesen, dass sich Reste von Desoxycholsäure in der Matrix befanden. Durch mehrmaliges Waschen der Matrix über 3 Wochen in PBS und längere Inkubationszeiten der Zellen auf der Matrix konnten bei den nächsten Besiedelungsversuchen die humanen Parotiszellen an die Oberfläche der Matrix adhärieren und einen Zellrasen bilden. Die Beschichtungsversuche der Oberfläche der Matrix trugen zu keiner sichtbaren Verbesserung der Adhärenz der humanen Parotiszellen auf der Matrix bei. Um die Frage der Vitalität der anhaftenden, humanen Parotiszellen auf den Konstrukten zu beantworten, wurden FDA/EB-Vitalfärbungen ausgeführt. Die Mehrheit der Zellen auf den Konstrukten der letzten Besiedelungsversuche fluoreszierte grün, was auf ihre Vitalität schließen lässt.Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Biokompatibilität der dezellularisierten, porcinen Speicheldrüse als Matrix für humane Parotiszellen gegeben ist. Weitere Versuche sind notwendig, um das Dezellularisierungsprotokoll besser anzupassen. Außerdem sollte durch immunhistolologische Färbungen nachgewiesen werden, ob die humanen Parotiszellen auf der Matrix ihre charakteristischen Eigenschaften beibehalten. Ein Ziel in der Zukunft wird die Dezellularisierung und Re-Besiedelung einer kompletten, porcinen Speicheldrüse für die Transplantation in den Menschen sein.

Patients who receive radiotherapy treatment in connection with a tumour in their head or in their neck will ultimately experience a loss of function of the salivary gland tissue. The dryness of the mouth resulting from this loss has an extreme effect on the patient s quality of life, as it leads to dysphagia, bacterial infection of the mouth cavity, tooth decay and a reduction of the sense of taste. Up to now research trials have not been able to come up with a concept that can adequately reduce this dryness of the mouth after radiotherapy treatment. One possible alternative to the currently available methods of treatment would be the application of tissue engineering. The aim here is to create an artificial salivary gland which can be implanted into the human organism after successful radiotherapy treatment, thus enabling the production of the necessary amount of saliva.Human parotid cells derived from different patients were cultivated in a 2-dimensional monoculture for several passages. This was followed by their characterisation. In order to develop an extracellular matrix, which is able to make a colonization with human and porcine salivary gland cells possible, porcine salivary gland cells were treated with a modified decellularization protocol for porcine jejunum, based on the method developed by Mertsching s working group (Mertsching et al., 2009). After the decellularization process, these cells were cut into small pieces. In order to improve the various factors influencing the adherence of the cells on the matrix, the matrices were washed with PBS for different lengths of time and were given pretreatment with various substances before the colonization process.The colonization with human and porcine salivary cells then took place with a varying number of cells and various lengths of incubation periods each time.The answer to the question as to whether the human parotid cells keep their characteristic features for several passages in a 2-dimensional in vitro monoculture would be the following: There was no reduction of the vitality and the growth behaviour of the human parotid cells in connection with the cultivation procedure in the 2- dimensional monoculture during the passages. These cells also retained their characteristical property of creating alpha-Amylase during the passages. This was proved by a histological staining process and on the basis of RNA. Aquaporine 5 water channels, however, did not develop. Referring to the question regarding how human parotid cells accept the decellularized porcine salivary gland as a matrix, the answer is that various results, each dependent on the colonization protocol, were achieved. When looking at the images under the scanning electron microscope and at the histological sections of the constructs, no cells could be identified on the surface. The cells on the surface of the cultivation plate that were not adherent to the matrix were also mainly avital. This was confirmed by the FDA/EB vital stains. A bile acid test was able to prove that a residue of sodium deoxycholate solution could be found in the matrix. Having repeatedly washed the matrix in PBS over a period of three weeks and with longer incubation periods of the cells on the matrix in advance, the human parotid cells were able to adhere to the surface of the matrix and create a cell layer during the next colonization experiments. The attempts to coat the surface of the matrix did not, however, lead to an improvement of the adhesiveness of the human parotid cells to the matrix. In order to test the vitality of the human parotid cells adhering on the constructs, FDA/EB vital staining procedures were performed. It could be observed that the majority of the cells were florescent green in colour; a fact which suggests their vitality. All things considered, it can be said that there is proof of the biocompatibility of the decellularized porcine salivary gland as a matrix for human parotid cells. Further experiments are necessary in order to make the decellularization protocol more suitable for the procedure. In addition it remains to be proved whether the human parotid cells do actually retain their characteristic properties with the help of an immune histological staining process. One important aim for the future will be the decellularization and the creation of a complete porcine salivary gland for human transplantation purposes.
Keywords: ddc:630