Isolierung und Charakterisierung von zellulären Interaktionspartnern des Matrixproteins M1 des Grippevirus Influenza A - Reinhardt, Jens; Justus Liebig University Giessen (My University, 2001)
Influenzaviren sind die Erreger der weltweit verbreiteten Virusgrippe. Diese Erkrankung führt bei uns jeden Winter zu Grippewellen, die sichin manchen Jahren zu Epidemien ausweiten können. Das Influenza A Virus, der Prototyp der Orthomyxoviren, ist darüber hinaus in derLage, Pandemien mit zum Teil dramatischen Ausmaßen auszulösen. Das Matrixprotein M1 der Influenza A Viren hat neben seiner strukturellen Rolle im Viruspartikel auch unterschiedliche regulatorischeFunktionen im viralen Replikationszyklus. Verschiedene Experimente deuten darauf hin, dass zumindest ein Teil dieser Funktionen durcheine Interaktion des viralen M1-Proteins mit zelluläre Komponenten vermittelt werden. Ziel dieser Arbeit war die Isolierung undCharakterisierung solcher zellulären Komponenten. In einem Hefe Zwei-Hybrid-Screen wurden 1,6 x 106 unabhängige Klone einer HeLa-cDNA-Genexpressionsbibliothek nach spezifischenInteraktionspartnern des M1-Proteins durchsucht. Dabei wurden unter anderem vier cDNAs mit Teilen der kodierenden Sequenz desRACK1 (Rezeptor der aktivierten C-Kinase (PKC)) isoliert. RACK1 besteht aus sieben sogenannten WD-Repeat-Domänen, die alsProtein-Protein-Adaptoren fungieren und ist hochgradig konserviert. Die Aminosäuresequenzen der homologen Proteine von Mensch,Schwein und Huhn sind identisch. Die gefundene Interaktion ließ sich in einem biochemischen Ansatz bestätigen. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass diese Interaktionzwischen den M1-Proteinen von Influenza A Virusstämmen mit unterschiedlicher Wirtsspezifität (Mensch, Schwein und Geflügel) und denentsprechenden (identischen) RACK1-Proteinen konserviert sind. Dies kann als Hinweis dafür gesehen werden, dass die RACK1-Bindungdurch das M1-Protein eine zentrale Rolle bei der Virusvermehrung spielt. Bei der Charakterisierung der Funktion der analysierten Interaktion konnte gezeigt werden, dass das M1-Protein durch die zelluläreProteinkinase C, die auch an RACK1 bindet, phosphoryliert werden kann. Deshalb kann angenommen werden, dass RACK1 alsPKC-Adaptor eine Rolle bei der M1-Phosphorylierung spielt. Außerdem wurde gefunden, dass eine Veränderung der RACK1-M1-Protein-Stöchiometrie im Verlauf einer Influenza A Virus-Replikationzu einer Inhibition der M1-Proteinexpression führt.

The influenza virus is world-wide pathogen which leads to seasonal waves of flu (influenza). The prototype of orthomyxoviruses, the influenzaA virus, also has the potential to cause pandemics with sometimes dramatic outcome. Beside its structural role within the virion, the matrix protein M1 of influenza A virus also has different regulatory functions in the viralreplication cycle. Some experiments indicate that at least some of these functions are mediated by cellular interaction partners of the viralM1 protein. The aim of this work was the isolation and characterization of such cellular components. Using a yeast two hybrid system, a total of 1,6 x 106 independent clones of a HeLa-cDNA library were screened for specific interactionpartners of the M1 protein. Among others, four cDNAs coding for the C-terminal part of RACK1, the receptor of the activated C-kinase(PKC), were isolated. RACK1 consists of seven WD repeat domains known to be involved in protein-protein interactions. The protein ishighly conserved. The amino acid sequences of the human, porcine and avian homologues are identical. This newly identified interaction was confirmed in a biochemical assay. It was also shown that this interaction was conserved for the M1proteins of influenza A virus strains with specificity for different hosts (human, swine, poultry) and the corresponding (identical) RACK1. Thispoints to a crucial role for the RACK1-M1 interaction in the viral replication cycle. During the characterization of this interaction the M1 protein was found to be phosphorylated by the PKC which also binds to RACK1. Forthat reason it is assumed that RACK1 plays a role as a PKC adapter for the M1 phosphorylation. Furthermore, it was shown, that a change in the stochiometry of the RACK1-M1 interaction in the infected cell leads to a depletion of the M1expression.
Keywords: Influenza A; Matrixprotein M1; Grippevirus; ddc:570