Untersuchung des Einfluss von CP190-Interaktionspartnern auf die CP190- und dCTCF-vermittelte Chromatinisolation in Drosophila melanogaster - Jox, Theresa; Justus Liebig University Giessen (My University, 2016)
Isolatoren sind Sequenzen der DNA, die verhindern dass DNA-Abschnitte ungehindert miteinander interagieren können. Dabei haben Isolatoren zwei Funktionen, die Enhancer-Blockade und die Barriere-Funktion. Die Barriere-Funktion verhindert das Interagieren von Chromatinabschnitten unterschiedlicher Stadien, während die Enhancer-Blockade eine Interaktion von Enhancer und Promoter unterbindet (Herold et al. 2012). Isolator-bindende Proteine (IBP) vermitteln dabei die Funktionen des Isolators, indem sie an diese binden. In Drosophila gibt es insgesamt neun IBP, von denen sieben die Unterstützung von CP190 (Centrosomal Protein 190 kDa) benötigen, um die Isolatorfunktion zu vermitteln. CP190 ist in der Lage, Brücken zwischen Isolatoren und Promotoren zu bilden (Liang et al. 2014). In dieser Arbeit wurden Interaktionspartner von CP190 untersucht, die CP190 für seine Funktion bei der Isolation benötigt. Massenspektrometriedaten, Immunpräzipitationen und ein Yeast Two Hybrid Screen zeigten, dass die Zinkfinger-assoziierte Domäne (ZAD) -Proteine, Pita, ZIPIC und cg30020, mögliche Interaktionspartner für CP190 sind (Maksimenko et al. 2015). ZAD-Proteine machen etwa 10 % aller Transkriptionsfaktoren (TF) in Dipteren aus und haben dieselben Zinkfinger-Typen, wie sie auch Zinkfingerproteinen (ZFP) vorkommen (Benson et al. 2009, Chung et al. 2007, Chung et al. 2002). Um den Einfluss von Pita, ZIPIC und cg30020 auf die Chromatinbindung zu untersuchen, wurden ChIP-Seq- und ChIP-qPCR-Experimente durchgeführt. Die ChIP-Seq-Analyse von Pita und ZIPIC zeigte dabei, im Vergleich mit ChIP-Chip-Daten von CP190, dass diese Faktoren stark mit CP190 kolokalisieren. Die anschließenden ChIP-qPCR-Experimente nach knock down von CP190 bzw. Pita oder ZIPIC, konten zeigen, dass die CP190-Bindung bedingt von ZIPIC und Pita abhängig ist. Dies deutete auf einen funktionellen Zusammenhang von CP190, Pita und ZIPIC bei der Bindung an Chromatin hin. Mit Pita und ZIPIC konnten zwei weitere Isolator-bindende Proteine zusätzlich zu den bisher bekannten IBPs in Drosophila gefunden werden, die wahrscheinlich durch ihre Bindung an bestimmte DNA-Sequenzen weiter regulatorische Funktionen bei der Isolation übernehmen (Maksimenko et al. 2015).Des Weiteren wurden alle Faktoren der SUMO-Kaskade, sowie eine SUMO-Protease, in einem RNAi-Screen in Drosophila S2-Zellen gefunden (Bohla et al. 2014). SUMOylierung ist eine Proteinmodifikation, mit vielfältigen Funktionen, deren Aufgabe bei der Isolation kontrovers diskutiert wird (Capelson and Corces 2006, Golovnin et al. 2012). Auch weitere Isolatoren, die durch CP190 gebunden werden, zeigten in einem funktionalen Reporterassay ebenfalls einen Reduktion der Isolation nach dem knock down von SUMO-Faktoren. Nach dem Nachweis der SUMOylierung von CP190 wurde eine ChIPseq-Analyse von diesem, dCTCF und FLAG-dSUMO nach vor und nach FLAG-dSUMO-Expression in S2-Zellen durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass dSUMO mit CP190 und dCTCF kolokalisiert und einen Einfluss auf die Bindung von CP190 hatte, was auch durch eine unabhängige bioinformatischen GEO-Analyse von ChIP-Seq-Daten bestätigte wurde. Die Zugänglichkeit des Chromatins wurde dabei durch die Expression von FLAG-dSUMO kaum beeinflusst, wie sich in Histon H3-ChIP und FAIRE-Assay zeigte. Dennoch war das Chromatin tendenziell etwas stärker geöffnet, sobald FLAG-His-dSUMO exprimiert wurde. Diese Resultate deuten darauf hin, dass SUMOylierung keine eindeutige Funktion bei der Isolation, bei der Bindung an Chromatin und bei der Zugänglichkeit des Chromatins einnimmt, sondern zu einer Homöostase beiträgt, indem eine dynamische SUMOylierung und De-SUMOylierung von Faktoren stattfindet, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wie CP190 oder Polycomb-Proteinen (Gonzalez et al. 2014).

Insulators are DNA regulatory sequences that preclude functionally distinct chromatin domains from improperly interacting with each other. They have two different functions: Enhancer blocking and barrier function. The barrier function prevents the interaction of chromatin domains with different activities, whereas the enhancer blocking insolates enhancers from promoters (Herold et al. 2012). Insulator-binding proteins (IBPs) mediate insulator function by binding these sequences. In Drosophila, nine IBPs are known and seven of them require CP190 (Centrosomal Protein 190 kDa) for mediating insulator function. CP190 bridges insulator, enhancer and promoter sequences (Liang et al. 2014). In this thesis new interacting partners of CP190, which assist in mediating insulator function, were analyzed. Mass spectrometry, immune precipitation (IP) and yeast two hybrid screen identified ZAD (zinc-finger associated domain) proteins, Pita, ZIPIC and cg30020, as potential interacting partners of CP190 (Maksimenko et al. 2015). ZAD proteins provide 10 % of all transcription factors (TF) in Dipteres and feature the same type of zinc-finger which can be found in zinc-finger proteins (ZFP) (Benson et al. 2009, Chung et al. 2007, Chung et al. 2002). ChIP-Seq and ChIP-qPCR experiments were performed to analyze the binding of Pita, ZIPIC and cg30020. ChIP-Seq analysis of Pita and ZIPIC showed a strong co-localization of those factors with CP190, when compared to ChIP-Chip data of CP190. The following ChIP-qPCR experiments after knock down of CP190 or of ZIPIC or Pita showed that CP190 binding is partially connected to ZIPIC and Pita binding. These findings point to a functional connection between CP190 and the analyzed ZAD proteins in the context of chromatin binding. Pita and ZIPIC are two new IPBs in Drosophila which provide further regulatory functions for insulation (Maksimenko et al. 2015).Other factors involved in CP190 function are proteins of the SUMO cascade, as well as a SUMO protease, which were found in an RNAi screen in Drosophila S2-cells (Bohla et al. 2014). SUMOylation is a protein modification which has various functions. The role in insulation is discussed controversially (Capelson and Corces 2006, Golovnin et al. 2012). Further analyses of other insulators by functional reporter assay showed a reduced insulator function after knock down of SUMO factors. A ChIP-Seq experiment was performed for CP190, dCTCF and FLAG-dSUMO with and without FLAG-dSUMO expression in S2-cells. Those analyses showed that the investigated factors co-localize and that CP190 binding is increased after expression of FLAG-His-dSUMO. These results were also confirmed by GEO-analysis. The accessibility of chromatin was weakly influenced by FLAG-dSUMO expression, which was shown by histon H3-ChIP and FAIRE assay. However the overall status of the chromatin indicated a tendency to an increased openness of the chromatin. These results indicate that SUMOylation has no clearly defined function during insulation, chromatin binding and chromatin state, but leads to homeostasis by dynamical SUMOylation and de-SUMOylation of factors involved in the corresponding processes, like CP190 and Polycomb proteins (Gonzalez et al. 2014).
Analyses of influence of CP190 interacting partners at the CP190 and dCTCF mediated chromatin insulation in Drosophila melanogaster
Keywords: Chromatinisolation; Isolatorproteine; Drosophila melanogaster; SUMOylierung; Chromatin insulation; insulator proteins; Drosophila melanogaster; SUMOylation; ddc:570