Lokalisation der 17 alpha-Hydroxylase-C17,20-Lyase (P450c17), 3beta-Hydroxysteroiddehydrogenase- delta 4/5 Isomerase (3beta-HSD) und Aromatase (P450arom) in der Plazenta beim Rind im Verlauf der Gravidität - Özalp, Gözde R.; Justus Liebig University Giessen (My University, 2005)
Zur weiteren Definition und Präzisierung möglicher parakriner und auto/intrakriner Wirkungen pla-zentarer Steroide beim Rind sollten mit vorliegender Arbeit ergänzende Informationen zur zellulären Lokalisation der an der Steroidsynthese beteiligten Enzyme erhalten werden. Insbesondere sollte dabei die steroidogene Kompetenz der beiden Trophoblastzellenarten des Rindes, der uninukleären Trophoblastzellen (UTC) sowie der meist zweikernigen Trophoblastriesenzellen (TGC), näher definiert werden. Dies sollte durch Darstellung der Expressionsmuster der Schlüsselenzyme 17a Hydroxylase-C17/20-Lyase (P450c17), 3beta-Hydroxysteroiddehydrogenase (3beta-HSD) und Aromatase erfolgen. Plazentome wurden von trächtigen Kühen zwischen dem 100. Graviditätstag und dem Zeitpunkt der Geburt gewonnen. Für die Immunhistochemie wurden diese in 10 %-igem neutralem Phosphat gepuffertem Formalin sowie in 4 %-igem Paraformaldehyd (PFA) für 24 Stunden fixiert und in Paraffin eingebettet. Zusätzlich wurden für die PCR kleine Gewebestücke in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Analyse bei 80 °C gelagert. Für den immunhistologischen Nachweis der Aromatase erwies sich eine 20 minütige Hitzvorbehandlung der Gewebeschnitte bei 95 ºC als erforderlich, beim Nachweis der P450c17 konnte dieser Schritt entfallen. Als Primärantikörper wurde ein Kaninchenserum gegen rekombinante menschliche Aromatase verwendet. Die Spezifität dieses Antikörpers wurde durch Western-Blot-Experimente an mikrosomalen Fraktionen aus Kotyledonengewebe bestätigt. Die Darstellung der P450c17 erfolgte unter Verwendung eines vom Kaninchen gewonnenen polyklonalen Antiserums gegen rekombinante P450c17 des Rindes. In den Negativkontrollen wurden die Primärantikörper durch Serum eines nicht immunisierten Kaninchens ersetzt. Die Darstellung der 3beta-HSD erfolgte mittels in situ Hybridisierung an formalinfixiertem Probenmaterial. Die verwendete Digoxigenin-gekoppelte Sonde wurde durch in vitro Transkription von PCR-generierten Matrizen gewonnen und entsprechen den Basen 619-860 einer publizierten, rinderspezifischen 3beta-HSD-Sequenz [Accession Nummer X17614]. Bezüglich der Expression der Aromatase ergaben sich spezifische Signale in den TGC. Die Signalstärke nahm mit zunehmendem Differenzierungsgrad zu und war besonders deutlich im Bereich der Primärzotten nahe der Chorionplatte. Unter der Geburt war das Signal weiterhin in den TGC erkennbar, die sich zu diesem Zeitpunkt in unterschiedlichen Stadien der Degeneration befanden. Die Expression von P450c17 wurde ausschließlich in den UTC beobachtet. Vom 110.-155. Trächtigkeitstag wurde P450c17 in allen Bereichen der Plazentome gleichmäßig exprimiert. In der Folgezeit war die P450c17-Expression weitgehend auf die Primärzotten sowie die Abzweigungen der Sekundärzotten beschränkt. Am 270. Graviditätstag war erneut in allen Teilen der Chorionzotten eine nahezu gleichmäßige, starke Expression vorhanden. Im Trophoblasten der Chorionplatte sowie im interkotyledonären Trophoblasten waren keine eindeutigen Signale für P450c17 erkennbar. Eine deutliche 3beta-HSD-Expression ergab sich in den UTC. Vereinzelt hatte es auch den Anschein, dass kleine, zweikernige Zellen, positiv waren. Aufgrund der methodebedingten Beeinträchtigung der Morphologie war jedoch nicht zu unterscheiden, ob es sich bei letzteren um einzelne, gerade aus einer Zellteilung hervorgegangene UTC oder um unreife TGC handelte. Somit könnte die Aufregulation der 3beta-HSD-Expression mit einem bestimmten Stadium des Zellzyklus in den UTC oder mit dem Beginn der TGC-Differenzierung assoziiert sein. Die Ergebnisse des immunhistologischen Aromatase-Nachweises zeigen, dass dieses Enzym im Trophoblasten ausschließlich in TGC exprimiert und offensichtlich gegen Ende der Gravidität aufreguliert wird. Die Expression von P450c17 erfolgte ausschließlich in den UTC. Da sich die TGC aus den UTC differenzieren, muss die Differenzierung der UTC in die TGC mit einer raschen Herunterregulierung der P450c17-Expression verbunden sein. Wie die semiquantative Bestimmung der P450c17-Expression zeigt, nimmt diese nach hohen Werten um die Graviditätsmitte in der Folgezeit deutlich ab, um zur Geburt hin wieder erheblich anzusteigen.

In order to further define and specify possible paracrine and/or auto-/intracrine effects of steroids secreted by the bovine placenta, the present work was designed to obtain information on the cellular localization of enzymes participating in steroid biosynthesis. Particular attention in respect to their steroidogenic capacity was given to the two distinct cell types forming the bovine trophoblast, the uninucleated trophoblast cells (UTC) and binucleated giant cells (TGC). In order to obtain this information it was attempted to demonstrate expression patterns of the following steroidogenic key enzymes: 17a hydroxylase-C17/20-lyase (P450c17), 3beta-hydroxysteroid-dehydrogenase (3beta-HSD) and aromatase. Placentomes were obtained from cows between day 100 of pregnancy and normal term. For immunohistochemistry they were fixed in 10 % neutral buffered formalin and in 4 % paraformaldehyd for 24 hours and then embedded in paraffin. For PCR, small tissue samples were shock-frozen in liquid nitrogen and stored at 80 °C until analysis. For the immunohistochemical detection of aromatase, heat treatment of tissue sections over 20 min-utes in an antigen unmasking solution proved to be necessary. This step could be omitted for detection of P450c17. The primary antibody used for the detection of aromatase was from a rabbit and directed against recombinant human aromatase. Specificity of the antiserum was confirmed using microsomal fraction prepared from cotyledons in Westen Blot. The primary polyclonal antiserum ap-plied for the detection of P450c17 was generated against bovine recombinant P450c17. Serum from non-immunized rabbit were used as negative control. Detection of 3beta-HSD was achieved by in situ hybridisation using formalin fixed paraffin embedded tissue samples. The digoxigenin coupled probes were prepared by in vitro transcription using PCR-generated templates and corresponded to the nucleotides 619-680 of a published bovine 3beta-HSD sequence [Accession Number X17614].
Keywords: ddc:630