Siadat, OlgaOlgaSiadat2023-03-032016-09-262023-03-032016http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-122793https://jlupub.ub.uni-giessen.de/handle/jlupub/11000http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10383Cyanobacteria occupy very diverse habitats with rapidly changing environmental conditions, which forces them to develop effective response mechanisms in order to survive. Post-transcriptional control of gene expression, which is mostly determined by the function of regulatory RNA molecules and the RNA degradation apparatus, provides an important mechanism for adaptation to environmental demands. Investigation of major players in RNA degradation and maturation in the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803, namely homologs of RNase E/G (Rne) and RNase III (Rnc2), was the main focus of the present work. As RNA chaperone Hfq, which facilitates otherwise imperfect sRNA-­mRNA base pairing, functions as a post-­transcriptional regulator of gene expression in many bacteria, we also studied two Hfq-­& #8208;dependent sRNAs Hpr8 and Hpr10 with a closer look on their degradation patterns.In order to clarify protein-­RNA interactions between studied RNases and their possible RNA targets in vivo a genome wide analysis of binding sites for Rne and Rnc2 was performed using individual-­nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) combined with Solexa high-throughput sequencing. This novel approach confirmed that Rne binds to the stem loop structure in the 5 UTR of rne gene and therefore most likely regulates its own synthesis in a similar manner as it has been shown for E. coli. Discovery of Rne binding sites within the rRNA precursor between 23S and 5S rRNAs led to the assumption that the maturation of 5S rRNA in Synechocystis is analogous to the one in E. coli. Conducted in vitro cleavage assays and a 3 RACE experiment substantiated this hypothesis and proved the accuracy of results provided by iCLIP method. We also revealed interaction of Rne with a number of sRNAs. In vitro cleavage assays were performed to verify Rne-dependent processing of some of the putative targets. Interestingly, we could see a clear pattern in Rne interaction with tRNAs: analysis of the location of the binding site determined that Rne always binds to the anticodon loop of tRNAs; an additional binding site at the variable loop of some tRNAs was also discovered.Evaluation of Rnc2 binding properties was completed by implementing iCLIP approach as well. Detection of Rnc2 binding sites within rRNAs and tRNAs suggested involvement of this RNase in maturation of their precursors in Synechocystis as it has been shown for other bacteria. We could also observe that the two studied RNases Rne and Rnc2 in some cases have binding sites mapped to the same transcripts and therefore might act together. In addition we could demonstrate using in vitro cleavage assays that the sRNA Hpr10 is a true substrate for Rnc2. iCLIP experiment revealed a binding site next to a long double-stranded region within this sRNA, where processing most likely occurs. In summary, we could show that the iCLIP method can be used for the study of RNase-­RNA interactions in bacteria. Verification of iCLIP data using in vitro assays confirmed that several RNAs are true targets of the respective RNases. Clearly, more comprehensive studies are needed in the future to analyse the specific functions of these ribonucleases in post-­& #8208;transcriptional gene regulation.Cyanobakterien besiedeln sehr vielfältige Habitate, in denen sich Umweltbedingungen sehr schnell ändern können. Dadurch sind Cyanobakterien gezwungen effektive Mechanismen zu entwickeln um sich an die jeweiligen Bedingungen anzupassen. Die posttranskriptionale Regulation der Genexpression, welche überwiegend durch kleine regulatorische RNAs und RNA-­Abbau bestimmt wird, stellt einen Mechanismus für die Anpassung an umweltbedingte Veränderungen dar. Die Untersuchung der wesentlichen Enzyme beim RNA-­Abbau und der RNA-­Reifung im Modelcyanobakterium Synechocystis sp. PCC6803, Homologe von RNase E/G (Rne) und RNase III (Rnc2), stellt den Kern dieser Arbeit dar. Da in vielen Bakterien das RNA-­Chaperon Hfq eine wichtige Rolle für die posttranskriptionale Regulation der Genexpression durch kleine nicht-­kodierende RNAs hat, wurden in dieser Arbeit auch die zwei Hfq-­abhängigen sRNAs, Hpr8 and Hpr10, vor allem bezüglich ihres Degradationsmuster näher untersucht.Für die Darstellung der RNA-­Proteininteraktionen zwischen untersuchten RNasen und deren möglichen RNA-­Zielen wurde eine genomweite Analyse der Bindungsstellen von Rne und Rnc2 in vivo -­ unter Verwendung der Methode der Individual Nucleotide Resolution Crosslinking und Immunoprecipitation (iCLIP), kombiniert mit Solexa-­High-­Throughput-Sequenzierung-­ durchgeführt. Dieser neuartige Untersuchungsansatz bestätigte, dass Rne an eine Stem-­Loop-­Struktur der 5 UTR der rne mRNA bindet und daher sehr wahrscheinlich die eigene Synthese in einer ähnlichen Weise, wie auch bei E. coli bekannt, reguliert. Die Entdeckung von Rne-Bindungsstellen in rRNA-­Vorstufen zwischen den 23S und 5S rRNAs führte zur Annahme, dass die Reifung der 5S rRNA in Synechocystis analog zu E. coli ist. Die durchgeführten in vitro Untersuchungen zur Prozessierung der rRNA und ein 3 -RACE-Experiment bestätigten die vorgenannte Hypothese und die Genauigkeit der Ergebnisse, welche durch die iCLIP-­Methode erlangt wurden. Zudem wurde eine potenzielle Interaktion zwischen Rne und einigen sRNAs identifiziert und durch in vitro Untersuchungen belegt. Interessanterweise wurde ein deutliches Muster in potenziellen Rne-­Interaktionen mit tRNAs deutlich: Die Analyse offenbarte, dass Rne an die Antikodon-Schleife verschiedener tRNAs bindet; eine zusätzliche Bindungsstelle an der variablen Schleife einiger tRNAs wurde ebenfalls postuliert.Die iCLIP-­Methode wurde auch für die Identifizierung von Rnc2-­RNA-­Bindestellen verwendet. Die detektierten Rnc2-Bindungsstellen in rRNAs und tRNAs legen die Beteiligung der RNase III an der Reifung dieser Produkte in Synechocystis, wie dies bereits für andere Bakterien bekannt ist, nahe. In dieser Arbeit wird auch ersichtlich, dass die RNasen Rne und Rnc2 teilweise an die gleichen Transkripte binden und daher sehr wahrscheinlich gemeinsam an der Prozessierung verschiedener RNAs beteiligt sind. Zusätzlich wurde durch in vitro-­RNA-­Spaltung verifiziert, dass die sRNA Hpr10 ein Substrat für Rnc2 darstellt. Die iCLIP-­Untersuchungen haben gezeigt, dass eine RNase-­Bindungsstelle neben einer langen doppelsträngigen Region in der sRNA besteht, dort, wo die Prozessierung sehr wahrscheinlich stattfindet.Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die iCLIP-­Methode erfolgreich für die Untersuchung von RNase-­RNA Interaktionen in Bakterien verwendet werden kann. Die Verifizierung von iCLIP-­Daten unter Verwendung der in vitro-­Spaltungsuntersuchungen hat bestätigt, dass einige RNAs echte Ziele der untersuchten RNasen sind. Sicherlich sind zukünftig noch weitere umfassende Analysen erforderlich, um die spezifischen Funktionen der hier untersuchten Ribonukleasen in der post-­transkriptionalen Genregulation besser zu verstehen.enIn Copyrightddc:570