Geisler, ClaudiaClaudiaGeisler2023-06-122001-07-012023-06-122001http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-4537https://jlupub.ub.uni-giessen.de/handle/jlupub/17520http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-16898Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin festzustellen, ob über eine Synchronisierung des Zellzyklus eine gerichtete Insertion vonFremd-DNS-Sequenzen in ein Empfängergenom (hier Daucus carota) mithilfe von Agrobacterium tumefaciens nachweisbar ist. Da eineInsertion auch außerhalb der DNS-Synthese-Phase vorstellbar ist, sollte der Einfluß verschiedener Transformationszeitpunkte im Verlaufdes Zellzyklus (in Stunden nach dessen erneuter Anregung mit Thymidin angegeben) auf den Einbau der Fremd-DNS geklärt werden.Durch die Verwendung eines Plasmid-Konstrukts unter der Kontrolle der eigenen Promotoren, das eine Kombination von rol-Genen(rolABC) beinhaltete, sollte ein morphologischer Marker geschaffen werden, der eine frühe visuelle Selektion und Bonitur der durch dieTransformation bedingten Veränderungen der Phytomorphologie erlaubte. Zur Durchführung der Versuche wurde der Zellzyklus der verwendeten Karottenzellsuspensionen (in B5-Medium mit2,4-Dichlorphenoxyessigsäure kultiviert) mithilfe von 2´-Fluoro-Desoxi-Uridin und 2´-Desoxi-Thymidin-Zugabe synchronisiert. Der Erfolg derSynchronisation wurde über eine Bisbenzimid-Färbung mit anschließender cytophotometrischer DNS-Messung ermittelt. Das PlasmidpPCV 002 mit der rol-Gen-Kombination ABC wurde in Agrobacterium tumefaciens inseriert. Zur Übertragung der Fremdgene in dasKarottengenom wurden die Agrobakterien mit der Daucus carota-Suspension cokultiviert, insgesamt zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nachInitiierung der S-Phase des Zellzyklus. Als Cokulturzeiten wurden 4, 8 und 48 Stunden verwendet. Nach Gewinnung von transgenenKarottenpflanzen über die somatische Embryogenese wurde deren DNS nach den üblichen Präparationsmethoden (Extraktions-Kit)aufbereitet, die Insertion der Fremdgene wurde anhand von PCR und Southern Blot bestimmt. Die Synchronisierung des Zellzyklus erreichte im Durchschnitt eine Rate von ca. 60% der Zellen. Bereits schon recht früh konnten abhängigvon der Dauer der Cokulturzeit Unterschiede in der Embryonalentwicklung festgestellt werden. Die Bonitur der transgenen Pflanzen erfolgtenach einem morphologischen Bonitierungs-Schema, in dem sechs sog. 'Morphotypen' unterschieden wurden. Eine eindeutige Abstufungdes Auftretens bestimmter Morphotypen zu definierten Transformationszeitpunkten oder abhängig von der Cokulturdauer konnte nichtgegeben werden. Die Durchführung von molekularbiologischen Methoden zum Nachweis der Insertion der rol-Gene in das Pflanzengenom(PCR) ergab, daß die ursprüngliche rol-Gen-Kombination rolABC nicht in jeder transgenen Pflanzen in toto nachweisbar war. Häufigkonnten nur einzelne rol-Gene oder Zweier-Kombinationen nachgewiesen werden. Bei der Betrachtung der durchgeführten Southern Blotskonnte nur eine tendenzielle Aussage gemacht werden. Es war zu beobachten, daß die meisten auftretenden Banden nicht den erwartetenRestriktionsfragmenten eines bestimmten Molekulargewichtsbereiches entsprachen. Deshalb wurde angenommen, daß dieseVeränderungen auf Methylierung und interne Umstrukturierungen der rol-Gen-Sequenzen zurückzuführen sind. Abschließend kann davon ausgegangen werden, daß eine gezielte Einflußnahme auf die gerichtete Insertion von Fremd-DNS durch eineZellzyklussynchronisierung nicht in vollem Maße möglich ist. Es muß jedoch über die Zellzyklussynchronisierung und die variableCokulturdauer eine gewisse Steuerungsfunktion vorhanden sein, die zur Ausbildung von 6, und nicht beliebig vielen, Pflanzenformen führt.Diese Hypothese wird bei der Betrachtung der Embryonalentwicklung insofern unterstützt, daß auch die Cokulturdauer bereits in diesenfrühen Entwicklungsstadien eine noch näher zu determinierende Wirkung besitzt.The object of this work was to determine whether cell-cycle synchronisation could induce directed insertion of foreign DNA sequences in ahost genome (here: Daucus carota) using the Agrobacterium tumefaciens system. Since an insertion could occur beyond the S-phase ofthe cell-cycle, it was necessary to determine the effect of different phases of the cell-cycle on the insertion event. In order to detect theinsertion a plasmid, containing a morphological marker (rol gene combination ABC under the own promoters) was used. The insertion ofthis plasmid into genomic DNA should allow for early visual selection based on the phytomorphological alteration resulting from insertion. Carrot cell suspensions (B5-medium with 2,4-dichlorophenoxic acid) were synchronized with 2´-Fluoro-Desoxi-Uridine and2´-Desoxi-Thymidine. The success of the synchronisation was examined by bisbenzimide dye followed by cytophotometric measurement.The plasmid, pPCV 002 containing rolABC, was initially inserted into Agrobacterium tumefaciens. In order to facilitate foreign genetransfer into the carrot genome, the transformed Agrobacteria were cultivated with the Daucus carota-suspension. TransformedAgrobacteria were added to synchronised carrot cell cultures at 8 different points post cell cycle following initiation of cell-cycle. Bacteriaand carrot cell cultures, started at each of the 8 points post cell cycle initiation, were cultured for 4, 8 or 48 hours. Plants resulting fromco-cultured carrot cells were then allowed to develop by somatic embryogenesis. The usual kits for DNA preparation were used, foreigngene insertion was tested by PCR and Southern Blot. Treatment of the carrot cell culture resulted in 60% synchronisation. The consequences of cocultivation could be seen early in embryogenicdevelopment and the differences were correlated with the duration of cocultivation. Transgene plants created using the coculture methodexhibited 6 distinct morphological patterns ('morphotypes'). Correlations between the expression of particular morphotypes and theaxperimental conditions could not be found. PCR analysis of the morphotypes indicated that the original rol gene combination, rolABC, wasnot integrated in every transgene plant in toto. Often, single rol genes or combinations of two rol genes could be detected using PCR.Southern blot analysis did not clarify the nature of the insertions as bands were not of the expected molecular weight; it is supposed thatmethylation or rearrangements resulted in the altered nature of the rol gene sequences. In conclusion, the data demonstrate that there is only a limited influence of cell-cycle synchronisation on the directed insertion of foreignDNA. There was however a discernable effect of the cell-cycle synchronisation and variable duration of the cocultivation, on thedevelopment of six morphological types. This hypothesis is supported by the observations of altered embryogenic development whereincocultivation seems to have an early effect. The mechanism by which the effect is mediated has yet to be determined.de-DEIn Copyrightrol-GenKarottenzellkulturddc:630