L-Plastin in humanen T-Lymphozyten : Kostimulations-abhängige Phosphorylierung an Ser-5 und Verlagerung in die Immunologische Synapse - Wabnitz, Guido; Justus Liebig University Giessen (My University, 2004)
T-Zellen zirkulieren unaufhörlich durch Blutgefäße und lymphatische Systeme, um die Umgebung nach passenden Antigenen abzusuchen. Bei der Erkennung eines Antigens auf Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) werden an der Kontaktzone zwischen APZ und T-Zelle hoch-organisierte Proteinkluster geformt, die sich in einem äußeren Adhäsionsring und einer zentralen Aktivierungs- bzw. Effektorzone anordnen. Diese so genannte Immunologische Synapse (IS) ist maßgeblich an der Aktivierung und Funktion der T-Zellen beteiligt. Für die Reifung der IS ist Kostimulation essentiell, d.h. neben Signal 1 über den T-Zell Rezeptor (TZR) benötigt die Zelle ein zweites Signal, das über akzessorische Rezeptoren wie CD28 oder CD2 vermittelt wird. Es gibt Hinweise darauf, dass über diese Kostimulation eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts verursacht wird, die letztlich für die Ausbildung von Rezeptor-Klustern in der IS unabdingbar ist. Es ist bislang nur ein Aktin-bindendes Protein beschrieben worden, das speziell nach Kostimulation modifiziert wird und die Brücke zwischen der dynamischen Umorganisation des Aktin-Zytoskeletts und Kostimulation schlagen könnte, nämlich Cofilin. Ein weiteres Aktin-bindendes Protein, L-Plastin, wird nach mitogener CD2-Aktivierung an Serinresten phosphoryliert, nicht aber nach alleiniger TZR/CD3 Stimulation. Über die Funktion von L-Plastin bei der T-Zell-Kostimulation war bisher nichts bekannt. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob L-Plastin über Kostimulation reguliert wird und an der Reifung der IS bzw. an der Klusterbildung von Rezeptoren beteiligt ist. Zunächst wurde gezeigt, dass L-Plastin nach klassischer Kostimulation über CD2 bzw. CD28 phosphoryliert wird. Um die Rolle der L-Plastin Phosphorylierung während der T-Zell-Aktivierung genauer untersuchen zu können, wurde die Phosphorylierungsstelle von L-Plastin durch Massenspektroskopie und gerichtete Mutagenese bestimmt. Dabei ergab sich, dass Ser-5 die einzige Phosphorylierungsstelle im L-Plastin-Molekül ist. Interessanterweise zeigten PBT, die cDNA kodiertes nicht-phosphorylierbares 5A-LPL exprimierten, eine Reduktion in ihrer Funktion, gemessen an dem frühen Aktivierungsmarker CD69.Aufgrund seiner Fähigkeit Aktin-Filamente, die für die Ausbildung einer reifen IS essentiell sind, zu bündeln, lag die Vermutung nahe, dass L-Plastin für die Bildung bzw. Stabilisierung von Rezeptor-Klustern in der IS wichtig sein könnte. Daher wurde zunächst der Frage nachgegangen, ob L-Plastin an der Klusterbildung von Rezeptoren, die durch Antikörper gegen Oberflächenmoleküle induziert wurden (Rezeptor-Caps oder Caps), beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden, dass sich L-Plastin an dem Pol der Zelle anreicherte, an dem sich auch das Cap befand, was erstmals darauf hindeutete, dass L-Plastin tatsächlich eine Rolle in der Bildung oder Stabilisierung von Rezeptor-Klustern spielt. Um diese Vermutung zu verifizieren, wurden die Effekte von Bromo-Phenacylbromid (BPB) auf Rezeptor-Caps untersucht. BPB ist eine niedermolekulare Substanz, die in geringen Konzentrationen selektiv und kovalent an L-Plastin bindet. Die Ausbildung von Caps wurde tatsächlich durch eine Vorinkubation von PBT mit BPB um ca. 90% reduziert. Dieser Effekt war transient, d.h. 5-6 Stunden nach der Vorinkubation bildeten etwa 30% der Zellen wieder Rezeptor-Caps aus. Innerhalb dieses Zeitfensters ( funktioneller Knock-out Zustand ) konnte mit cDNA exprimiertem wildtyp-L-Plastin die Bildung von Rezeptor-Caps teilweise rekonstituiert werden, wodurch eine direkte Funktion von L-Plastin an der Bildung von Rezeptor-Klustern postuliert werden kann. Eine erneute Cap-Bildung konnte auch mit einer nicht-phosphorylierbaren L-Plastin Mutante (5A-LPL) erzielt werden. Diese war aber verglichen mit der Rekonstitution über wildtyp-L-Plastin deutlich schwächer. Dieser Unterschied deutet darauf hin, dass die L-Plastin Phosphorylierung eine stabilisierende Wirkung auf die Rezeptor-Kluster ausübt. Zusammenfassend konnte durch diese Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass das über T-Zell-Kostimulation phosphorylierbare Aktin-bündelnde Protein L-Plastin an der Bildung bzw. Stabilisierung von Rezeptor-Klustern beteiligt ist.
Keywords: ddc:570