Generierung und Charakterisierung eines neuen Tiermodells für Zellweger Syndrom (PEX19 KO-Maus) zum Studium der peroxisomalen Membranbiogenese - Beck, Anja Christina; Justus Liebig University Giessen (My University, 2009)
Peroxisomen sind Zellorganellen, die in allen eukaryotischen Zellen vorkommen. IhreHauptfunktionen liegen im Intermediärstoffwechsel reaktiver Sauerstoffverbindungen, demAbbau verschiedener Fettsäuren, von Eicosanoiden, Leukotrienen, Glycero- und Etherlipidensowie von Cholesterin. Sind Peroxisomen des Menschen in ihrer normalen Funktion gestört,kommt es zu einer Reihe von schwerwiegenden, immer tödlich verlaufenden Erkrankungen. Dieschwerste Form einer peroxisomalen Erkrankung, das cerebrohepatorenale Syndrom oder auchZellweger Syndrom, entsteht durch fehlerhafte Biogenese dieser Zellorganellen und dem damitverbundenen kompletten Ausfall aller peroxisomaler Stoffwechselwege. Da peroxisomaleStoffwechselwege auch andere Zellorganellen (z.B. glattes endoplasmatisches Retikulum,Mitochondrien, Cytoplasma) mit einschließen, scheitern häufig biochemische Untersuchungsmethoden.Das gezielte Ausschalten von Genen für die Peroxisomenbiogenese mit Hilfemoderner gentechnischer Methoden ermöglicht jedoch die Analyse der molekularen Folgeneiner Peroxisomen-Defizienz. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine sog. Knockout (KO)-Mausmit PEX19-Defekt hergestellt, und die Rolle des cytoplasmatischen Pex19p-Proteins bei derperoxisomalen Membransynthese untersucht.Bisher wurden drei Proteine der Peroxinfamilie (Pex3p, Pex16p, Pex19p) mit der Synthese derperoxisomalen Membran in Verbindung gebracht. Das Pex19p spielt als cytoplasmatischesChaperon und Shuttle-Rezeptor für peroxisomale Membranproteine bereits im frühen Stadiumder Membranentstehung dieser Organellen eine wichtige Rolle. Sowohl durch histologische alsauch durch biochemische Analysen konnte nachgewiesen werden, dass diese Maus ähnlichephänotypische Merkmale zeigt, wie sie in bisher etablierten Knockout-Mausmodellen mitMatrixproteinimportdefekten oder auch bei Patienten mit Zellweger Syndrom beschriebenwurden. Mit dieser PEX19 KO-Maus konnten zellbiologische Untersuchungen in Bezug aufperoxisomale Membranreststrukturen ( ghosts ) und auf den zielgerichteten Einbauperoxisomaler Membran- und Matrixproteine ( targeting ) durchgeführt werden. Weiterhinwurden bisher unbekannte Veränderungen im Muster von mehrfach ungesättigten Fettsäurennachgewiesen.Im Zuge der phänotypischen Charakterisierung wurde nachgewiesen, dass bei Abwesenheit vonPex19p der Import von peroxisomalen Membran- und Matrixproteinen gestört ist. So werdenverschiedenste peroxisomale Membranproteine in andere Organellen (z.B. Mitochondrien)fehlgeleitet, und Matrixproteine verbleiben im Cytoplasma oder werden komplett abgebaut.Darüber hinaus konnten in Hepatocyten der PEX19 KO-Mäuse knäuelartige Lipid-Membranstrukturen in der Nähe von Glykogenfeldern nachgewiesen werden, an denen inWildtyptieren normale Peroxisomen zu finden sind. Diese Strukturen wurden bisher in keinerFibroblastenzelllinien von Patienten mit Defekten in den an der Membranbiogenese beteiligtenperoxisomalen Proteinen Pex3p, Pex16p und Pex19p beschrieben.In dieser Studie wurden außerdem fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zur Ablauf derNeuentstehung von Peroxisomen in primären embryonalen Fibroblasten von PEX19 KOMäusendurchgeführt, die ein eindeutiges Muster bei der Peroxisomenentstehung und reifungvermuten lassen.

Peroxisomes are ubiquitous organelles, present in all eukaryotic cells. They play an essentialrole in several important metabolic processes, such as the degradation of reactive oxygenspecies, the breakdown of toxic and bioactive fatty acids, or the synthesis of eicosanoidsleucotriens, glycerolipids, ether lipids and cholesterol. The vital importance of this organellefor normal cellular homoestasis and the survival of the whole organism are highlighted byseveral lethal inherited autosomal-recessive diseases known as peroxisomal biogenesisdisorders of the Zellweger Syndrome spectrum. Because peroxisomes are functionally crosslinkedto other cell compartments, such as smooth endoplasmatic reticulum, mitochondriaand cytoplasm, biochemical analysis are often not successful to study the function of thisorganelle. In contrast, the knockout of peroxisomal biogenesis genes by genetic engineeringallows studying the molecular consequences of peroxisomal deficiency. In the present study,knockout (KO) mice with Pex19p-deficiency have been generated to study the role of thePex19p protein during peroxisomal membrane biogenesis.Three peroxins, Pex3p, Pex16p and Pex19p, are suggested to be involved in the early stepsof peroxisomal membrane biogenesis. A bifunctional role of Pex19p as a chaperone and asan import receptor for peroxisomal membrane proteins at the peroxisomal membrane hasbeen proposed. Several histological and biochemical analyses revealed that the newlygenerated PEX19 KO mice exhibited a phenotype similar to formerly established knockoutmouse models with peroxisomal matrix protein import defects and patients with Zellwegersyndrome. However, the PEX19 KO mouse showed cell biological differences in relationshipto peroxisomal residual membrane structures ( ghosts ) and the targeting of peroxisomalmembrane proteins. Furthermore hitherto unknown changes in levels of polyunsaturated fattyacids have been detected.Phenotypical characterisation revealed that PEX19 knockout mice exhibited an import defectof both peroxisomal membrane and matrix proteins. Peroxisomal membrane proteins weremistargeted to other organelles like mitochondria, whereas peroxisomal matrix proteins weremislocalised to the cytoplasm and the nucleus or were degraded. In addition in hepatocytesof the PEX19 KO mice loop- or whorl-like membrane structures, suggestive for peroxisomal membrane ghosts , were detected in the vicinity of glycogen areas, where normalperoxisomes would be located in wildtype animals. This is the first description of theseresidual membrane structures, which have not been found in corresponding human patientfibroblasts before.Furthermore, the kinetic of peroxisomal membrane and matrix protein import was studied byimmunofluorescence analyses in primary cultures of embryonic mimmunofluorescence analyses in primary cultures of embryonic mouse fibroblasts at differenttime-points after complementation with PEX19-cDNA.
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