Untersuchung an Bioaerosolen in Tierställen unter Etablierung einer REAL-TIME PCR-basierten Methode zur Erfassung luftgetragener Salmonella und Thermoactinomyces Zellen - Fallschissel, Kerstin; Justus Liebig University Giessen (My University, 2011)
Bioaerosole aus bzw. in landwirtschaftlichen Tierställen beinhalten häufig hohe Konzentrationen an Mikroorganismen in stark zeitlich und räumlich variierender Zusammensetzung. In diesen Ställen arbeitende Menschen sind damit potentiell infektiösen und Allergie-auslösenden Mikroorganismen und deren Bestandteilen oder Stoffwechselprodukten exponiert, die ein erhebliches Gesundheitsrisiko darstellen können.Die kultivierungsbasierte Untersuchung von Bioaerosolen eines Putenstalles erfasste im Vergleich zur molekularbiologischen Methode einen geringeren Anteil vorhandener Organismen bei gleichzeitig geringerer Diversität. Insgesamt wurden 28 Isolate durch die kultivierungsabhängige Analyse gewonnen und nach Sequenzierung des 16S rRNA Gens 19 Arten zugeordnet. Dominierend waren Gensequenzen mit höchster Ähnlichkeit zu Sequenzen der Gattungen Nocardiopsis (n=4), Bacillus (n=4) und Brevibacterium (n=3). Innerhalb der Klonbibliotheken (n=165) dominierten Sequenzen des 16S rRNA Gens mit höchster Sequenzähnlichkeit zu Spezies der Gattungen Aerococcus, Lactobacillus und Megamonas für beide Probenahmeorte unabhängig von der Sammelmethode. Anhand beider Methoden wurden Organismen mit einem potentiellen Gesundheitsrisiko (Risikogruppe 2) für den Menschen nachgewiesen (u. a. Acinetobacter johnsonii, Pantoea agglomerans, Aerococcus viridans, Shigella flexneri).Die umfassende Untersuchung des Einflusses der Sammlung auf die Lebensfähigkeit einzelner Stämme anhand der Lebend-Tot-Färbung zeigte sehr heterogene Ergebnisse, die auf eine stamm- oder speziesspezifische Widerstandsfähigkeit gegenüber den Effekten durch die Filtration und das Impingement hinweisen. Für Salmonella Typhimurium CIP 60.62T konnten nach 30 Minuten Beaufschlagung mittels Impingement noch 90,8% der Zellen als lebend detektiert werden, nach 20 Minuten Filtrationsbeaufschlagung nur noch 18%. Zellen von Bacillus subtilis DSM 10T zeigten bei beiden Methoden keine Beeinflussung der Lebensfähigkeit. Für Zellen von Escherichia coli DSM 30083T wurden schon nach 10 Minuten Filtrationsbeaufschlagung keine Zellen mehr als lebend detektiert. Die stärksten Absterbe-Effekte auf Zellen der untersuchten Stämme zeigte insgesamt die Filtration. Da molekularbiologische Methoden die Organismen unabhängig vom Lebenszustand erfassen, spielt die biologische Sammeleffizienz beim Nachweis anhand der Realtime PCR nur eine untergeordnete Rolle. Vielmehr ist ein möglichst hoher Erfassungsgrad des Sammelsystems ausschlaggebend. Im Vergleich war in dieser Arbeit die physikalische Sammeleffizienz für die Filtration durchschnittlich 40% höher als beim Impingement. Dies wird vor allem auf eine Vorabscheidung von Partikeln im Einlasssystem des AGI-30 Impingers zurückgeführt. Die Etablierung eines spezifischen Nachweissystems auf Basis der Realtime PCR zur schnellen Quantifizierung von Mikroorganismen aus Bioerosolen am Beispiel einer infektiösen (Salmonella sp.) sowie einer Allergie-auslösenden Bakterien-Gruppe (Thermoactinomyces sp.) wurde entwickelt. Verluste waren vor allem methodisch durch die DNA-Extraktion bedingt. Die Größenordnung der Wiederfindung variierte in Abhängigkeit vom eingesetzten Verfahren und der eingesetzten Zellzahl zwischen 23,3% und 58,2%. Hemmeffekte durch Matrixmaterial auf die Realtime PCR traten nicht auf, konnten jedoch nicht grundlegend ausgeschlossen werden. Ein sekundäres Ziel war eine mögliche Standardisierung zur Gefährdungsbeurteilung von Arbeitsplätzen basierend auf den validierten Nachweissystemen.

Today s large-scale poultry production with densely stocked and enclosed production buildings is often accompanied by very high concentrations of airborne microorganisms leading to a clear health hazard for employees working in such environments.In this study, the cultivation-based approach determined lower proportions of abundant microorganisms concomitant with a lower diversity compared to the parallel applied molecular approach. 16S rRNA gene sequences of the 28 obtained isolates were allocated to 19 species, with highest sequence similarity to sequences of the genera Nocardiopsis (n=4), Bacillus (n=4) and Brevibacterium (n=3). Within the clone libraries (n=165) sequences showed highest sequence similarity to species of the genera Aerococcus, Lactobacillus and Megamonas. Sequences allocated to these genera were predominantly found at both sampling sites independent from the sampling method. By both, cultivation-based and molecular methods, species comprising a potential health risk for employees (Acinetobacter johnsonii, Aerococcus viridans, Pantoea agglomerans, and Shigella flexneri) were identified. Live-dead-staining was applied for a detailed analysis of influence by the sampling method on bacterial cell viability. Here, heterogeneous results were detected, indicating a strain- or species-specific resilience against stress due to filtration and impingement sampling. 90.8% of Salmonella Typhimurium CIP 60.62T cells were detected alive after 30 minutes of impingement but only 18% after 20 minutes of filtration. Cells of Bacillus subtilis DSM 10T showed no affection of viability by both sampling methods. In contrast, after 10 minutes of filtration all cells of Escherichia coli DSM 30083T were detected as dead. Altogether, most cells of the investigated strains died throughout filtration sampling. As molecular methods determine organisms independently from their life status biological sampling efficiency is negligible for real-time PCR quantification. In fact, most important is the coverage of the applied sampling system. In this study, physical sampling efficiency was on average 40% higher for filtration compared to impingement. This was basically ascribed to a pre-deposition of particles in the inlet system of the AGI-30 impinger. A fast and specific real-time PCR quantification system has been implemented for an infectious (Salmonella sp.) as well as an allergenic (Thermoactinomyces sp.) model organism group. Processing losses were mainly attributed to DNA extraction. Total recovery varied as function of applied sampling procedure between 23.3% and 58.2%. Inhibition by co-extracted bioaerosol components on real-time PCR was not documented but cannot be excluded completely. Further objective of this work was standardization of the validated process intended for work place risk assessment.
Analysis of bioaerosols from livestock houses by a REAL-TIME PCR-based method for detection of airborne Salmonella and Thermoactinomyces cells
Keywords: Bioaerosole; Realtime PCR; Salmonella; Thermoactinomyces; Luftgetragen; Bioaerosol; Realtime quantitative PCR; Salmonella; Thermoactinomyces; airborne; ddc:570