Proteinbiochemische Untersuchungen des Siebröhrensaftes von Hordeum vulgare zur Identifizierung von systemischen Signalen für eine erhöhte Resistenz nach Befall mit Blumeria graminis - Knauer, Torsten; Justus Liebig University Giessen (My University, 2012)
Mit Hilfe der erleichterten Exsudation mit EDTA und der Probenentnahme mittels Stylektomie wurden phloemspezifische Proben aus Gerste gewonnen. Mit einer Untersuchung der Siebröhrenproteine nach Befall mit Blumeria graminis (Bgh) sollten Rückschlüsse auf (Protein)-Signale gewonnen werden, die eine systemisch erhöhte Resistenz nach Bgh-Befall vermitteln. Dazu wurde für beide Probenentnahmetechniken eine zweidimensionale Proteintrennung etabliert. Zusätzlich wurde das prinzipbedingte Verunreinigungspotential der EDTA-Methode verifiziert.Nach einer Inokulation der Blattspitzen konnte ein erhöhter Anteil (16-22hai) von P23K-3 bzw. dem nahezu identischen Protein P23K-4 (P23K-3/4) in EDTA-Proben ermittelt werden. Mit Hilfe der Stylektomiemethode konnte keine Hochregulierung von P23K-3/4 nach Bgh-Befall festgestellt werden, jedoch wurde gezeigt, dass die in der Stylektomie eingesetzten Aphiden ebenfalls zu einer Hochregulierung von P23K-3/4 führen. Die im Gel ermittelten unterschiedlichen Fokussierungspunkte von P23K-3/4 nach R.padi- und Bgh-Befall lassen sich nicht auf die unterschiedliche Aminosäuresequenz der Proteine, sondern wahrscheinlich auf eine unterschiedliche posttranslationale Modifikation zurückführen. Nach einem R.padi-Befall des 2. Blattes und der Entfernung des 2. Blattes vor der Probenentnahme konnte aus den verbleibenden Blättern ebenfalls eine erhöhte Menge von P23K-3/4 in EDTA-Exsudaten festgestellt werden. Dabei konnte nicht ermittelt werden, ob das Protein in der Pflanze systemisch verteilt oder systemisch induziert wurde. Eine Behandlung der Gerste mit dem chemischen Resistenzinduktor DCINA führte, im Gegensatz zum Befall mit Bgh, zu einer verminderten Menge von P23K-3/4 in EDTA-Exsudaten. Eine Wirkung von Jasmonsäure auf die Expression des Proteins konnte nicht festgestellt werden. Anhand von Literaturhinweisen konnte für P23K-3/4 eine Rolle in der Zellwandverstärkung nach Befall mit Bgh ermittelt werden. In diesem Zusammenhang wurde eine um 11% erhöhte Zellwandmasse nach Bgh-Befall des 2. Blattes in den restlichen Blättern ermittelt. Die erhöhte Zellwandmasse deutet auf eine systemische Verstärkung der Zellwand hin, die möglicherweise zu einer erhöhten Resistenz gegen Bgh beiträgt. Neben dem Schwerpunkt der phloemspezifischen Proteinanalyse wurde außerdem eine verminderte Translokationsgeschwindigkeit in Siebröhren nach Inokulation mit Bgh ermittelt. Anhand von Literaturhinweisen lässt sich diese mit elektrischen Signalen im Phloem der Gerste in Verbindung bringen. Ein Calciumsignal im Siebelement könnte damit der Ausgangspunkt für vielfältige Reaktionen bezüglich einer Proteinexpression, der Aktivierung von Proteinkinasen und weiterer Abwehrkomponenten sein. Außerdem konnte eine systemisch erhöhte Peroxidaseaktivität nach Befall mit Bgh und R.padi bestimmt werden. Dies deutet auf eine Involvierung von H2O2 in der systemischen Signalvermittlung nach Pathogenbefall hin.

Aphid stylectomy and EDTA-facilitated exudation were used to obtain sieve-tube sap samples to identify shifts in the (protein)-composition of barley phloem sap, which are indicative for systemic signalling after infection with Blumeria graminis (Bgh). For both sampling techniques a two-dimensional protein separation was established including an arsenal of purification steps for EDTA-probes. Potential contamination by artefactual proteins induced by the EDTA method was verified.Increased levels of P23K-3 or the nearly identical protein P23K-4 (P23K-3/4) were found 16-22hai with Bgh in EDTA samples. No up-regulation of P23K-3/4 after Bgh infection was observed using aphid stylectomy. However, it was shown that aphid infestation (and in particular stylet insertion) lead to up-regulation of P23K-3/4. The different isoelectric points of P23K-3/4 obtained in sieve-tube samples after R.padi infestation and inoculation with Bgh could not be explained by the slightly different amino acid sequences of the proteins but are likely due to different post-translational modifications. After R.padi infestation of the second leaf and removal of the second leaf prior to sampling, the remaining leaves also showed increased amounts of P23K-3/4 in EDTA exudates. Treatment of barley leaves with the chemical resistance inductor DCINA led, in contrast to infestation with Bgh, to a reduced amount of P23K-3/4 in EDTA exudates. This indicates involvement of jasmonic acid in the expression/production of P23K-3/4, but direct effects of jasmonic acid on the P23K-3/4 levels could not be detected. According to literature sources, P23K-3/4 plays a pivotal role in secondary cell wall formation. In this context, the present work points to a systemically induced cell wall reinforcement which was confirmed by an 11% increase in dry weight of systemic leaves of infected plants. After inoculation with Bgh, reduced exudation from sieve tubes was found which points to a reduced mass flow in phloem. Most likely, the decreased exudation rate was triggered by electrical long-distance signals propagated subsequent to inoculation. A accompanying Ca2+ influx may trigger a cascade of events in parenchymatous cells along the phloem pathway leading to, among others, an increased activity of peroxidases and the expression of P23K-3/4. It is unclear, if these substances were distributed or induced systemically. In any event, this conglomerate of reactions after Bgh-infection leads to higher deposition of phenolic substanes and cellulose in systemic leaves and, hence, to a putative higher resistance.
Keywords: ddc:570