Synthese und Transport von Signalen im Phloem nach Verwundung, Induktion einer Pathogenresistenz und abiotischem Stress - Gaupels, Frank; Justus Liebig University Giessen (My University, 2006)
In dieser Arbeit wurden physiologische und molekulare Muster von Reaktionen des Phloems auf diverse Reize untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurden mit Hilfe des cDNA-AFLP (cDNA-amplified fragment length polymorphism) Teilsequenzen von 11 Transkripten im Phloemsaft aus Gerstenpflanzen ermittelt. Drei Transkripte, zu denen auch die mRNA des Abwehrproteins Carboanhydrase gehört, wurden ausschließlich nach chemischer Induktion von Pathogenresistenz gefunden. Die Transkripte sind damit Kandidaten für systemisch transportierte Resistenzsignale. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit Funktionen des Signalmoleküls NO im Phloem. In mikroskopischen Studien mit dem NO-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluoresceindiacetat konnte in den Geleitzellen des Phloems von Vicia faba eine starke NO-Synthese beobachtet werden. Diese NO-Synthese wurde durch exogene Applikation von Salicylsäure und H2O2 ausgelöst. Ein pilzlicher Elicitor und Jasmonsäure bewirkten dagegen eine vergleichsweise schwache NO-Synthese. Pharmakologische Analysen zeigten, dass im Phloem eine Ca2+- und L-Arginin-abhängige NO-Synthase (NOS) aktiv ist. Während Vicia faba gut geeignet ist für die in vivo-Mikroskopie des Phloems, können aus dieser Pflanze jedoch nur sehr geringe Mengen Phloemsaft gewonnen werden. Daher wurden biochemische Untersuchungen mit Phloemproben aus Kürbispflanzen vorgenommen. Nach Verwundung, Hitzestress und Behandlung mit dem Resistenzinduktor BION konnte in Western Blots mit Nitrotyrosin-Antikörpern eine zunehmende Nitrierung von Phloem-proteinen festgestellt werden. Außerdem wurden mit der Biotin switch-Methode potenzielle nitrosylierbare Proteine im Phloemsaft nachgewiesen. Insgesamt wurden 12 Proteine identifiziert, darunter die Phloemproteine 16 und 36 sowie zwei Peroxidasen, die Glyoxalase I und die 25-26 kD große Isoform des Phloemprotein 2 (PP2). Das letztere Protein wurde wahrscheinlich sowohl an Cysteinresten nitrosyliert als auch an Tyrosinresten nitriert. Durch Behandlung von Kürbis-Phloemproben mit NO-Donoren wurden die antioxi-dativen Enzyme Ascorbatperoxidase (APX) und die Superoxiddismutase (SOD) in vitro inhibiert. Einen ähnlichen Effekt hatten Verwundung, Resistenzinduktion und Hitzestress in vivo. Wenn vor dem Hitzestress die Versuchspflanzen mit einem NOS-Inhibitor behandelt wurden, konnte die Hemmung der APX und SOD fast vollständig verhindert werden. Das deutet an, dass diese Enzyme nach Hitzestress direkt oder indirekt durch NO gehemmt wurden. Mit dem gleichen Inhibitor wurde außerdem die partielle Fällung des Phloem-proteins 1 und einer 24,5 kD großen PP2-Isoform nach Reizung der Pflanzen unterdrückt. PP1 und PP2 sind redoxsensitive Proteine, deren Fällung wahrscheinlich ein Absinken des Redoxpotentials im Siebelement anzeigt. Die Ergebnisse werden in Bezug auf eine mögliche Rolle von NO in Redox-abhängigen systemischen Signalkaskaden diskutiert.

In this work, physiological and molecular patterns of responses of the phloem to various stimuli were investigated. Utilising cDNA-AFLP (cDNA-amplified fragment length poly-morphism) partial sequences of 11 gene transcripts in barley phloem exudates were received. Three transcripts, of which one coded for the defence-related carboanhydrase, were detected exclusively after chemical induction of pathogen resistance. These mRNAs are candidates for systemically translocated resistance signals. The second part of the PhD project dealt with functions of the signal molecule nitric oxide in the phloem. Microscopic studies with the NO-specific fluorescent dye diaminofluoresceine diacetate revealed a strong NO-synthesis in companion cells of the phloem of Vicia faba. The NO burst was induced by exogenously applied salicylic acid and H2O2. A fungal elicitor and jasmonic acid were less effective inducers. Pharmacological approaches demonstrated that a Ca2+- and L-Arginin-dependent NO synthase (NOS) is active in the phloem. After wounding of leaves, heat stress, and treatment with the resistance inducing chemical BION an increase in nitration of proteins in pumpkin phloem sap was recognised using western blot analyses with nitrotyrosine antibodies. Furthermore, potentially nitrosylated phloem proteins were detected by the biotin switch method. 12 proteins were identified, among them the phloem proteins 16 and 36, two peroxidases, glyoxalase I, and a 25-26 kD isoform of the phloem protein 2 (PP2). The latter protein was probably nitrosylated at cysteine residues as well as nitrated on tyrosine residues. Treatment of pumpkin phloem sap with NO donors caused a decrease in activity of the antioxidant enzymes ascorbate peroxidase (APX) and superoxide dismutase (SOD), wounding, resistance induction, and heat stress had a similar effect. Pretreatment of plants with a NOS inhibitor suppressed the inhibition of APX and SOD after heat stress, indicative for a regulation of the enzymes by NO. The NOS inhibitor also prevented the partial precipitation of the phloem protein 1 and of the 24,5 kD PP2 isoform after diverse treatments of pumpkin plants. PP1 and PP2 are redoxsensitive proteins whose precipitation could indicate a drop of the redox potential in the sieve elements. These results are discussed in terms of a potential role of NO in redox-dependent systemic signal cascades.
Synthesis and transport of signals in the phloem after wounding, induction of pathogen resistance and abiotic stress
Keywords: Phloem; systemische Stresssignale; NO; mRNA; Resistenz; phloem; systemic signalling; NO; mRNA; resistance; ddc:580