Regulatory mechanisms of tumor initiation, growth and invasion: the function of isocitrate dehydrogenase 1, acidosis and ephrinB2 - Bögürcü-Seidel, Nuray; Justus Liebig University Giessen (My University, 2018)
Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Among central nervous system tumors, glioblastoma is the most common and most aggressive tumor entity. Despite new therapeutic strategies and a better understanding of the molecular mechanisms leading to tumorigenesis, the median glioblastoma patient survival is only 15 months.A hypoxic tumor microenvironment is one of the characteristics of glioblastoma and tumor hypoxia has been linked to multiple hallmarks of cancer, including tumor promoting inflammation, metabolic reprogramming, angiogenesis, invasion and metastasis. The main effectors of the cellular response to hypoxia are the hypoxia-inducible transcription factors (HIFs), whose stability is tightly regulated through hydroxylation by the prolyl hydroxylase domain proteins (PHDs). The latter require oxygen and 2-oxoglutarate (2-OG) as co-substrates to hydroxylate specific residues within HIF-a, which eventually leads to HIF-a degradation under normoxia. Under hypoxia, PHDs are inactive and HIF-a is stabilized. Activation of the hypoxic response is not only mediated by hypoxia, but also by the accumulation of the oncometabolite 2-hydroxyglutarate, which can modulate PHD activity. Identification and characterization of oncogenic mutations leading to the accumulation of oncometabolites acting as 2-oxoglutarate (2-OG) analogs, showed the central role of 2-OG in the regulation of cellular responses. We therefore hypothesized that isocitrate dehydrogenases (IDHs), which convert isocitrate to 2-OG, might play a central role in the maintenance of 2-OG levels and hence the regulation of 2-OG dependent enzyme activity. In line with this hypothesis, we show that IDH1 knock-down results in reduction of 2-OG levels, accompanied by the activation of the hypoxic response as a direct result of PHD inhibition, evidenced by reduced HIF-a hydroxylation. In order to directly demonstrate the involvement of 2-OG in this process, we treated IDH1 knock-down cells with cell permeable 2-OG. Importantly, addition of 2-OG suppressed the IDH1 knock-down-mediated increase of HIF-a levels and HIF-a target gene expression. Since these findings demonstrated that IDH1-dependent changes in 2-OG control PHD activity, we examined if IDH1 silencing also influences other PHD-regulated signaling pathways, such as NF-?B signaling. In line with our previous findings, IDH1 silencing-mediated PHD inactivation led to increased NF-?B nuclear translocation and activation of NF-?B downstream targets. Additionally, we demonstrated that the cancer stem cell (CSC) phenotype, which has been closely linked to HIF-a activation, is also enhanced by IDH1 silencing and reverted by 2-OG treatment. Importantly, we could show that aberrant 2-OG levels also modulate invasion and the expression of Snail, a key regulator of mesenchymal transition, which plays a crucial role in the control of tumor invasion. In line with the cell culture-based data, our in vivo experiments verified the effects of IDH1 silencing on the induction of invasive characteristics, as well as activation of HIF-a and NF-?B signaling and the stem cell phenotype in tumors. Additionally, we identified TGFß, an inducer of mesenchymal transition, as a regulator of IDH1. Strikingly, in breast and lung cancer cells, tumor types in which metastasis is the primary cause of death, IDH1 silencing induced similar molecular changes, including activation of HIF-a signaling and increased expression of Snail. Most importantly, IDH1 silencing in this context resulted in increased metastasis. In addition to accumulating cancer cell-intrinsic changes, tumors reshape their own microenvironment, contributing to the acquisition of cancer hallmarks and tumor progression. One typical consequence of metabolic reprogramming under hypoxia is acidification of the tumor microenvironment. Therefore, in a second part of this work, we aimed to understand the molecular mechanisms controlled by the combination of acidosis and hypoxia in the tumor microenvironment, and its effect on tumorigenesis. We show that an acidic tumor microenvironment promotes the CSC phenotype and even further potentiates the hypoxic response, suggesting a role for acidosis in tumorigenesis and tumor therapy resistance. We revealed that acidosis controls HIF-a function through heat shock protein 90 (HSP90). Strikingly, absence or inactivation of HSP90 under acidic conditions reduced tumor initiation, tumor hypoxia and tumor growth. Importantly, we found that HSP90 levels correlate with hypoxic and stem cell marker genes in glioblastoma patients. Among the cancer hallmarks that are regulated by hypoxia, are the activation of invasion and the induction of angiogenesis. In the third part of this work, we focused on hypoxia-dependent mechanisms that regulate these capabilities. We show that hypoxia, which can be promoted by inhibition of angiogenesis, induces local glioma invasion and downregulates the cell adhesion molecule ephrinB2. Importantly, we reveal that ephrinB2 downregulation is directly controlled by ZEB2, a target of HIF-1a, establishing a critical role of a HIF-1a-ZEB2-EphrinB2 axis in glioma invasion, including invasion induced by anti-angiogenic agents. Notably, absence of ephrinB2 increased tumor invasiveness, whereas ephrinB2 overexpression decreased it, revealing a crucial function of ephrinB2 in the control of the invasive capacity of gliomas. Taken together, our results demonstrate the pivotal role of 2-OG for the control of PHD activity, the hypoxic response and downstream biological processes, such as CSC maintenance, invasion and metastasis. Additionally, we also revealed distinct molecular mechanisms through which hypoxia regulates cancer hallmarks, namely enhancing tumor invasion via a HIF-1a-ZEB2-EphrinB2 axis, or synergizing with acidosis to control the CSC phenotype and tumor growth through HSP90. These findings identify several mechanisms, centered around the control of hypoxic signaling in tumors, which regulate cancer hallmarks and may provide targets for future therapeutic strategies.

Tumorerkrankungen sind, nach Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems, die häufigste Todesursache weltweit. Unter den Tumoren des zentralen Nervensystems ist das Glioblastoma multiforme die häufigste und aggressivste Tumorentität. Trotz neuentwickelter, multimodaler Therapieansätze und einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Tumorentstehung zugrunde liegen, bleibt die mittlere Überlebenszeit von Glioblastompatienten mit etwa 15 Monaten seit Jahrzehnten nahezu gleich. Zwei charakteristische Eigenschaften des Mikromillieus im Glioblastom sind die Existenz nekrotischer Bereiche, sowie eine dysfunktionale Gefäßstruktur, die zu Tumorbereichen mit reduzierter Sauerstoffversorgung (Hypoxie) führen. Tumorhypoxie steht in Zusammenhang mit verschiedenen Schlüsselcharakteristiken von Tumorerkrankungen (Hallmarks of Cancer) wie der Adaption des Stoffwechsels, Angiogenese, tumorassoziierte Entzündungsreaktionen, Invasion und Metastasierung. Die Haupteffektoren der zellulären Adaption an Hypoxie sind die hypoxie-induzierten Transkriptionsfaktoren (HIF-1a und HIF-2a), deren Stabilität mittels Hydroxylierung durch Prolylhydroxylasen (PHDs) reguliert wird. Diese PHDs benötigen Sauerstoff und 2-Oxoglutarat (2-OG) als Co-Substrat, um spezifische Prolylreste zu hydroxylieren, was zur Degradation von HIF-a unter Normoxie führt. Unter Hypoxie ist die Aktivität der PHDs inhibiert, was mit einer Stabilisierung von HIF-a einhergeht. Die Aktivierung der Hypoxie Antwort erfolgt indes nicht ausschließlich durch reduzierte Sauerstoffkonzentrationen, sondern kann auch durch die Akkumulation des Onkometaboliten 2-Hydroxyglutarat, dass die Aktivität von PHDs beeinflussen kann, begünstigt werden. Die Identifikation und Charakterisierung pro-onkogener Mutationen, die zur Anreicherung dieses Onkometaboliten, der als 2-Oxoglutarat Analogon dient, unterstreicht die zentrale Rolle, die 2-OG in der Regulation zellulärer Prozesse einnimmt.Hierauf gründet unsere Hypothese, dass Isocitrat-Dehydrogenase, ein Enzym, das Isocitrat zu 2-OG konvertiert, eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung der 2-OG Level, und damit der Regulation von 2-OG abhängiger Enzymaktivität, spielt. Tatsächlich zeigen unsere Ergebnisse, dass ein knock-down von IDH1 zu einer Reduktion adäquater 2-OG Level führt, was mit einer Aktivierung der Hypoxie-Antwort einhergeht. Weiterhin konnten wir anhand verminderter HIF-a-Hydroxylierung zeigen, dass diese Aktivierung des Hypoxie-Response auf einer verminderten Aktivität der 2-OG abhängigen PHDs basiert. Um diese Ergebnisse weiter zu untermauern und eine direkte Abhängigkeit dieser Prozesse von 2-Oxoglutarat zu verifizieren, wurden IDH1 knock-down Zellen mit einer zellpermeablen Variante von 2-OG behandelt. Tatsächlich unterdrückte die Zugabe von 2-OG die, durch den IDH1 knock-down bedingte, Aktivierung der Hypoxie-Antwort. Da diese Ergebnisse eindeutig belegen, dass IDH1-abhängige Veränderungen der 2-OG Level die Aktivität von PHDs regulieren, interessierte uns, ob der knock-down von IDH1 auch weitere PHD-regulierte Signalwege wie den NF-?B Signalweg beeinflusst. In Übereinstimmung mit unseren vorherigen Ergebnissen konnten wir zeigen, dass eine IDH1 knock-down abhängige Inaktivierung der PHDs auch zu einer vermehrten Translokation von NF-?B in den Zellkern, und damit einhergehend einer Aktivierung von NF-?B Zielgenen, führte. Zusätzlich zu diesen Ergebnissen konnten wir zeigen, dass der Tumorstammzellphänotyp, der eng mit der Aktivierung des Hypoxie-Response verknüpft ist, durch IDH1 Silencing erhöht, und anschließend mittels 2-OG Behandlung rückgängig gemacht werden konnte. Interessanterweise konnten wir zudem zeigen, dass anomale 2-OG Level Invasion und die Expression von Snail, einem Schlüsselfaktor der mesenchymalen Transition, der eine wichtige Rolle in der Regulation der Tumorinvasion spielt, modulieren. In Übereinstimmung mit unseren zellkulturbasierten in vitro Daten konnten wir die Schlüsselrolle, die IDH1 für die Tumorprogression spielt, auch in in vivo Experimenten verifizieren. Im Tumormodell zeigte sich, dass IDH1 knock-down, ebenso wie im Zellkulturexperiment, eine bedeutende Rolle für die Regulation von Tumorinvasion, der Aktivierung der HIF-a und NF-?B Signalwege, sowie des Tumorstammzellphänotyps spielt. Weiterhin konnten wir TGF, einen Aktivator der mesenchymalen Transition, als einen IDH1 Regulator identifizieren. Bemerkenswerterweise führte ein IDH1 knock-down in Brust- und Lungenkarzinomen, Tumorentitäten, bei denen sich bildende Metastasen die häufigste Todesursache darstellen, zu ähnlichen molekularen Adaptionen wie der Aktivierung des HIF-a-Signalweges, oder der erhöhten Expression von Snail, führte. Am interessantesten jedoch war, dass IDH1 knock-down im in vivo Tiermodell zu erhöhter Metastasierung der Primärtumore führte.Zusätzlich zur Akkumulation tumorzellintrinsischer Adaptionen verändern Tumore aktiv das Tumormikromillieu, was mit einer Akquisition weiterer Hallmarks of Cancer und einer erhöhten Tumorprogression einhergeht. Eine typische Folge der Tumorstoffwechseladaption unter Hypoxie ist die Azidifizierung des Tumormikromillieus. Aus diesem Grund haben wir uns im zweiten Teil dieser Arbeit mit molekularen Mechanismen, und deren Einfluss auf die Tumorprogression, beschäftigt, die synergistisch durch Azidose und Hypoxie reguliert werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ein azidisches Tumormikromillieu die Hypoxieantwort von Tumorzellen potenziert und den Tumorstammzellphänotyp reguliert, was auf eine Rolle der Tumorazidose für Tumorinitiierung und Therapie-Resistenz schließen lässt. Mechanistisch zeigen unsere Ergebnisse, dass Azidose die Hypoxieantwort der Zellen über das Heat Shock Protein 90 (HSP90) aktiviert. Hierbei führte die Inaktivierung oder der knock-down von HSP90 unter azidischen Bedingungen zu verminderter Tumorhypoxie und Tumorwachstum. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen konnten wir in Patientenbiopsien zeigen, dass die Expressionslevel von HSP90 positiv mit denen von Hypoxie- und Tumorstammzellmarkern korrelieren.Unter den Hallmarks of Cancer, die durch Hypoxie reguliert werde, findet sich neben der Tumorinvasion vor allem die Aktivierung der Tumorangiogenese. Im dritten Teil dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die hypoxieregulierten Mechanismen, die Tumorangiogenese, und damit das Tumorwachstum positiv beeinflussen. Wir konnten zeigen, dass Tumorhypoxie, die auch durch die therapeutische Inhibition von Tumorangiogenese hervorgerufen werden kann, zu einer Herunterregulierung des Zellädhäsionsmoleküls ephrinB2, und daraus resultierend einer lokalen Verstärkung der Tumorinvasion führte. Mechanistisch zeigten unsere Ergebnisse, dass die Reduktion der ephrinB2 Expression direkt durch das HIF-1a Zielgen ZEB2 kontrolliert wird, was erstmals die Existenz einer HIF-1a-ZEB2-ephrinB2 Achse im Glioblastom beweist, die Tumorinvasion, auch vermittelt durch anti-angiogene Therapeutika, kontrolliert.Fasst man die Ergebnisse dieser Arbeit zusammen, konnten wir eine zentrale Rolle des Metabolits 2-Oxoglutarat für die Kontrolle der PDH Aktivität und damit der Hypoxieantwort, sowie der durch diese regulierten Mechanismen und Tumorcharakteristika wie Tumorstammzellhomöostase, Invasion und Metastasierung, identifizieren. Weiterhin konnten wir neue Mechanismen entschlüsseln über die eine HIF-1a-ZEB2-ephrinB2 Achse Tumorinvasion, sowie Tumorazidose mittels HSP90 den Tumorstammzellphänotyp reguliert. Unsere Ergebnisse unterstreichen die zentrale Rolle, die Tumorhypoxie für die Regulation von Schlüsselmechanismen des Tumorwachstums spielt und offenbaren hierdurch potenzielle Ziele neuer Therapiestrategien.
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