Untersuchungen zur Proteinbiosyntheseaktivität humaner Thrombozyten - Dobrowolski, Christiane A.; Justus Liebig University Giessen (My University, 2008)
Thrombozyten werden auch Blutplättchen genannt und sind die kleinsten zellulären, kernlosen Bestandteile des Blutes. Neben ihrer Hauptfunktion bei der primären und sekundären Hämostase haben sie entscheidenden Einfluss auf die sich anschließende Wundheilung. Infolge einer Gefäßverletzung entsteht im Zusammenspiel von Thrombozytenaggregation und Gerinnungskaskade ein Thrombus, um einen möglichst raschen Gefäßverschluss zu erzielen; dabei erfolgt die Aktivierung und Aggregation der Thrombozyten. Durch die Ausbildung von Pseudopodien vergrößern sie ihre Oberfläche zur Präsentation von Zelladhäsionsrezeptoren. Des Weiteren kommt es im Rahmen der Aktivierung zur Degranulation, d.h. zur Freisetzung der Mediatoren aus den Speichergranula. Auch bei den während der Gefäßverletzung initiierten Prozessen der akuten Inflammation mit dem Ziel einer unspezifischen Immunabwehr, sowie der Gefäß- bzw. Geweberegeneration, übernehmen Thrombozyten wichtige Aufgaben: Die während der Aktivierung freigesetzten Mediatoren haben nachweislich chemotaktische, mitogene und auch antibakterielle Wirkungen. So werden inflammatorische Effektorzellen in das geschädigte Gewebe gelockt und durch Zelladhäsionsrezeptoren an der Thrombozytenoberfläche immobilisiert. Bis jetzt noch ungeklärt ist, ob Thrombozyten darüber hinaus Wachstumsmediatoren bzw. Mediatoren generell durch de novo Proteinsynthese zum Erhalt langfristiger Wirkungen bereitstellen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Aspekt der de novo Proteinbiosynthese in Thrombozyten näher untersucht. Dazu wurden zwei verschiedene Verfahren des Nachweises einer Proteinsynthese gewählt: Die radioaktive Proteinmarkierung und Proteingelanalyse dienen dem allgemeinen Nachweis neu gebildeter Proteine. Hierzu wurden leukozytendepletierte Thrombozyten in Anwesenheit einer radioaktiv markierten Aminosäure (35S-Methionin) mit und ohne Agonist (Thrombin oder ADP) inkubiert. Den Vergleichsansätzen wurden autologe Leukozyten hinzugefügt. Mittels 1D- bzw. 2D-Gelelektrophorese erfolgte die Auftrennung der Proteinextrakte aus den Ansätzen. Durch eine im Anschluß folgende Autoradiographie konnten die radioaktiv markierten, aus der de novo Proteinbiosynthese entstandenen Proteine sichtbar gemacht werden. Positive Ergebnisse im Sinne eines radioaktiven Proteins konnten bei diesen Untersuchungen nur dann erzielt werden, wenn eine Kontamination durch Leukozyten vorlag. Der spezifische Nachweis von Wachstumsfaktoren, die für die Wundheilung relevant sind (IL-1ß, pro IL-1ß und VEGF), erfolgte mittels ELISA. Dazu wurden die Thrombozytenpräparate mit und ohne Kontamination durch Leukozyten mittels Thrombin bzw. ADP stimuliert und anschließend noch 17-20h in Zellkulturmedium inkubiert. Die Messungen der Proteinkonzentrationen erfolgten vor und nach Inkubation. Des Weiteren wurde einem Vergleichsansatz Puromycin als Translationshemmer beigefügt. Auch dieser spezifische und quantitative Ansatz zum Nachweis von de novo Proteinsynthese führte nur dann zum positiven Ergebnis (= Anstieg der Proteinkonzentration), wenn eine Kontamination mit Leukozyten vorlag. Aus den Daten der vorliegenden Arbeit ist eine de novo Proteinbiosynthese und damit die nachhaltige Bereitstellung von Mediatoren durch aktivierte Thrombozyten über die einmalige Freisetzung hinaus unwahrscheinlich. Der Widerspruch zu der in der Fachliteratur beschriebenen Proteinbiosynthese in Thrombozyten könnte durch die unterschiedlichen Präparations- und Aufreinigungsverfahren begründet sein. Das Ausmaß der Leukozytenkontamination scheint hierbei einen entscheidenden Faktor darzustellen.

Thrombocytes, or blood platelets, are the smallest cellular anuclear constituents of the blood. Apart from their main function of being involved in the cellular mechanism of primary and secondary hemostasis, they play a decisive role in subsequent wound healing. Once a blood vessel is injured, thrombocyte aggregation and coagulation cascading lead to the formation of a thrombus in order to repair the damaged vessel quickly. Thrombocytes are activated and aggregated. By forming pseudopodia, they extend their surface area to present cell adhesion receptors. Activation also leads to degranulation, that is, the release of mediators from storage granules. Thrombocytes also play an important role in the acute inflammation processes initiated by vessel damage (aiming at a non-specific immune response), as well as vessel- and tissue regeneration. The mediators released during activation have demonstrable chemotactic, mitogenic, and antibacterial effects. Inflammatory effects cells are lured into the damaged tissue and are immobilized by cell adhesion receptors on the thrombocyte s surface. Until now, it is not clear whether thrombocytes also provide growth or other mediators through de novo protein synthesis to maintain long-term effects. The paper presented here concerns an investigation of de novo protein synthesis in thrombocytes. To do this, two different processes for identifying protein synthesis were used. Radioactive protein markers and protein gel analysis are generally used to identify newly-created proteins. Leucocyte-depleted thrombocytes were incubated in the presence of a radioactively-marked amino acid (35s-methionine), both with and without an agonist (thrombin or ADP). In a parallel test series, autologous leucocytes were added. Protein extracts were separated from each test series by means of 1-D and 2-D gel electrophoresis. Subsequent autoradiography was used to make visible the radioactively-marked proteins resulting from de novo protein biosynthesis. Positive results, in the sense of a radioactive protein, could only be achieved if there was leucocyte contamination. Specific proof of growth factors relevant to would healing (IL-1ß, pro IL1ß, and VEGF) was determined by ELISA. For this purpose, the thrombocyte preparations, both contaminated and uncontaminated by leucocytes, were stimulated with thrombin or ADP and then incubated in a cell culture medium for 17-20 hours. Protein concentrations were measured before and after incubation. Additionally, puromycin was added to one test series as a translation inhibitor. This specific and quantitative approach to identifying de novo protein synthesis also led to a positive result (increased protein concentration) only if contaminated by leucocytes. The data in this paper indicates that de novo protein synthesis, and hence the sustained provision of mediators by activated thrombocytes, is improbable after one-time release. This contradiction to protein biosynthesis in thrombocytes described in technical literature may be due to the different preparation- and purification procedures used. The extent of leucocyte contamination appears to play a decisive role in this case.
Keywords: ddc:630