Regulation of autophagy in animal models of pulmonary fibrosis - Ahuja, Saket; Justus Liebig University Giessen (My University, 2020)
Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), characterized by progressive decline in lung function, is associated with histological appearance of usual interstitial pneumonia (UIP). To define pathogenesis of lung fibrosis, several mouse models have been developed. Bleomycin is the most frequently used agent to drive lung fibrosis in mice. Apart from bleomycin model, AECII injury and apoptosis were reported as important triggers in other mouse models like Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) associated lung fibrosis and amiodarone induced lung fibrosis. HPS is an autosomal recessive disorder characterized by bleeding diathesis, occuculocutaneous albinism and pulmonary fibrosis in patients. Aim of this study is to analyze regulation of autophagy in HPSIP and bleomycin model of lung fibrosis. Autophagy is a lysosome dependent quality control mechanism of cell to maintain cellular homeostasis and promote cell survival under stressful conditions.In our study, key autophagy proteins including LC3BII and p62 were found to be increased in HPS1/2 double mutant mice lungs. Electron microscopy revealed preferable LC3B binding to the lumen of lamellar bodies in HPS1/2 while it was found in both the lumen as well as on the limiting membrane of lamellar bodies in wildtype mice. After HPS1 knockdown in A549 cells, p62, an autophagy substrate protein accumulated indicating defective autophagy pathway. Exogenous LC3B normalized HPS1 knockdown induced p62 protein levels. A549 cells post HPS1 knockdown also showed a decrease in the formation of autophagolysosomes. We overexpressed and immunoprecipitated HPS1 protein from A549 cells and identified specific autophagy related proteins as HPS1 interacting proteins via mass spectrometric analysis. Bleomycin treated mice lungs showed increase in autophagy proteins. MLE12 cells, upon bleomycin treatment revealed decrease in autophagy flux but showed increased levels of cleaved caspase-3 indicating induction of apoptosis post bleomycin treatment. We performed co-imunoprecipitation followed by mass spectrometric analysis to identify interaction partners for autophagy marker protein, LC3B within the alveolar epithelial cells. Our analysis revealed novel interacting partners for LC3B.This study concludes that defective autophagy pathway observed both, in response to HPS1 knockdown and bleomycin challenge might play a critical role in the development and progression of pulmonary fibrosis. Understanding functions of autophagy by analyzing novel interaction partners of its marker proteins within the alveolar epithelial cells may help to further understand the mechanisms behind the contribution of defective autophagy towards the development of lung fibrosis.

Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) repräsentiert eine der aggressivsten Formen von Organfibrosen. Sie ist durch eine fortschreitende Verringerung der Lungenfunktion charakterisiert und wird mit dem histologischen Erscheinungsbild einer herkömmlichen interstitiellen Pneumonie assoziiert (UIP). Um die Pathogenese der Lungenfibrose zu definieren, wurden bereits einige Mausmodelle entwickelt. Hierbei stellt Bleomycin das am häufigsten verwendete agens dar, um eine Lungenfibrose bei Mäusen auszulösen. Abgesehen von diesem Bleomycin Modell wurden auch Schädigungen der AEII und Apoptose als mögliche Auslöser erkannt, etwa bei Mausmodellen für Hermansky-Pudlak Syndrom (HPS) assoziierte Lungenfibrose und Amiodarone induzierter Lungenfibrose. HPS ist eine autosomal rezessive Erkrankung, die charakterisiert ist durch Blutungsdiathese, Ceroid-Lipofuszin Akkumulation, okulokutanen Albinismus und pulmonale Fibrose. Mutationen im HPS Gen verursachen Fehler im Proteintransport. Das Ziel dieser Studie ist es, die Regulation der Autophagie in HPSIP und im Bleomycin Modell für Lungenfibrose zu analysieren. Bei der Autophagie handelt es sich um einen von den Lysosomen abhängigen Qualitätskontrollmechanismus einer Zelle, der darauf abzielt, die zelluläre Homöostase aufrecht zu erhalten und das Überleben der Zell in Stresssituationen zu unterstützen. In unserer Untersuchung konnten wir zeigen, dass Autophagie Proteine inklusive LC3B Lipidation und p62 in den Lungen der HPS 1/2 Doppelmutanten Mäusen erhöht waren. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten eine zu bevorzugende LC3B Bindung an das Lumen der Lamellarkörper bei den HPS1/2, während diese sowohl im Lumen als auch in der limitierenden Membran der Lamellarkörper in wild-typischen Mäusen zu finden war. Unter HPS1 knock-down Bedingungen in A549 Zellen, akkumulierte das Autophagie Substrat Protein SQSTM1/p62, was auf einen defekten Autophagie Signalweg hindeutet. Exogenes LC3B normalisierte die von HPS1knock-down induzierten p62 Proteinlevel. A549 Zellen zeigten nach HPS1 knock-down ebenfalls eine Verringerung der Formation von Autophagie Lysosomen. Wir über-exprimierten und immunpräzipitierten HPS1 Protein aus A549 Zellen und identifizierten spezifische Autophagie bezogene Proteine wie etwa HPS1 interacting Proteine durch massenspektrometrische Analyse. Mit Bleomycin behandelte Mäuselungen zeigten einen Anstieg der Autophagie Markerproteine. MLE12 Zellen zeigten bei Bleomycin Behandlung eine Verringerng des Autophagie Flux, aber gesteigerte Level an gespaltenen Caspase3, was eine Induktion der Apoptose nach Bleomyzin Behandlung nahelegt.Wir führten eine Co-Immunopräzipitation durch, gefolgt von einer massenspektrometrischen Analyse, um wichtige Interaktionspartner für das Autophagie Marker Protein LC3B in den alveolaren Epithelzellen zu identifizieren. Unsere Analyse zeigte neuartige Interaktionspartner für LC3B. Die Studie kommt zu dem Schluss, dass defekte Autophagie Signalwege wie sie sowohl als Antwort auf HPS1 knock-down als auch bei Bleomyzin Behandlung beobachtet werden, eine Rolle bei der Entwicklung und Progression der Lungenfibrose spielen könnten. Die Funktionen der Autophagie durch die Analyse neuer Interaktionspartner ihrer Markerproteine in den alveolaren Epithelzellen zu verstehen könnte helfen, die Mechanismen hinter dem Beitrag defekter Autophagie an der Entwicklung von Lungenfibrose zu verstehen.
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