Biotechnologische Darstellung und analytische Charakterisierung aromaaktiver Fettaldehyde - Hammer, Andreas Klaus; Justus Liebig University Giessen (My University, 2021)
Eine große Bandbreite an Geruchsqualitäten und vergleichsweise niedrige Geruchsschwellen machen Aldehyde für die Aromaindustrie zu einer interessanten Substanzklasse. Trotz diverser Lösungsansätze fehlt allerdings nach wie vor eine nachhaltige Produktionsmethode mit hoher Ausbeute. Aus diesem Grund wurde ein biotechnologischer Ansatz verfolgt, der unter Einsatz rekombinant exprimierter Enzyme die Gewinnung von Aldehyden aus fungalen Lipiden erlaubt. Letztere stellen dabei eine nachhaltige Quelle für selten vorkommende Fettsäuren dar. Dazu wurden zunächst ca. 40 verschiedene Pilz-Spezies als potentielle Produktionsorganismen vielversprechender Fettsäuren untersucht. Die Pilze wurden in Schüttelkolben kultiviert und die neutralen Lipide mittels Soxtherm(R)-Apparatur aus den Myzelien extrahiert. Auf diese Weise wurden Lipidausbeuten zwischen 30 mg (L. edodes) und 1,9 g (C. heterosporus) pro Liter Nährmedium ermittelt. Die Fettsäureprofilanalysen mittels GC-MS zeigten in Übereinstimmung mit der Literatur, dass es sich bei den Hauptbestandteilen primär um Linol-, Öl- und Palmitinsäure handelte. Ausnahmen bildeten C. heterosporus und zwei Mortierella-Stämme, die größere Mengen an Arachidonsäure produzierten. Bemerkenswerterweise enthielt das Myzel der Conidiobolus-Spezies zudem hohe Anteile mehrerer iso- und anteiso-methylver-zweigter Fettsäuren. Daneben wurden aber auch weitere ungewöhnliche Komponenten detektiert, so etwa die endständig desaturierte Dodec-11-ensäure (12:1(11)) in F. velutipes oder die omega 8-ungesättigte (9Z)-Heptadec-9-ensäure (17:1(9Z)) in M. hyalina. Durch Variation der Kulturparameter wurde deren Einfluss auf die Bildung der beiden zuletzt genannten Substanzen untersucht und damit die Kulturführung der beiden Pilze diesbezüglich optimiert. Durch den Zusatz von L-Isoleucin wurde die Ausbeute von 17:1(9Z) auf ca. 70 mg pro Liter Nährmedium gesteigert. Für 12:1(11) wurden bis zu 20 mg pro Liter Nährmedium erreicht. Über Supplementationsstudien war es darüber hinaus möglich, die terminale Desa-turierung 13C-markierter Laurinsäure durch F. velutipes nachzuweisen. Damit wurde ein wichtiger Beitrag zur Aufklärung der Biosynthese der in der Natur selten vorkommenden omega 1-ungesättigten Fettsäuren geleistet. Die Triglyceride der fungalen Lipidextrakte wurden schließlich mit Hilfe einer Lipase aus C. rugosa hydrolysiert. Die freigesetzten Fettsäuren wurden wahlweise mit heterolog in E. coli ex-primierter und affinitätschromatographisch gereinigter alpha-Dioxygenase oder Carbonsäure-Reduktase zu Aldehyden umgesetzt. Die Biotransformationsprodukte wurden mittels HS-SPME-GC-MS-O analysiert und sensorisch evaluiert. Während die Reaktionsprodukte der 17:1(9Z) olfaktorisch kaum wahrgenommen werden konnten, wiesen die Produkte der 12:1(11) deutlich wahrnehmbar sensorisch ansprechende Qualitäten auf. Aufgrund dessen wurde eine homologe Reihe (C7 bis C13) dieser omega 1-ungesättigten Aldehyde chemisch synthetisiert und instrumentell-analytisch (GC-MS, NMR, z.T. HRMS) sowie sensorisch charakterisiert. Dabei wurden Geruchsschwellen von 0,039 bis 29 ng/L in Luft bzw. 0,24 bis 22 μg/L in wässriger Lösung bestimmt, wobei Non-8-enal die potenteste Substanz darstellte. Alle Aldehyde wiesen einen grünen Geruch auf. Grasige Noten mit Nuancen nach Gurke bzw. Melone waren charakteristisch für die C7- und C8-Aldehyde, während mit Non-8-enal ein medizinischer Geruchseindruck nach Pappe assoziiert wurde. Mit steigender Kettenlänge zeichneten sich die Aldehyde wiederum durch einen seifigen Geruch nach Koriander-Blättern aus, der zum Teil krautige und wächserne Züge annahm. Analog wurde mit einer homologen Reihe iso- und anteiso-methylverzweigter Fettaldehyde (C12 bis C15) verfahren, die biotechnologisch hergestellt wurden. Die Geruchsschwellen dieser Aldehyde betrugen in Luft 0,18 bis 70 ng/L. Die niedrigsten Schwellen zeigten die beiden C14-Isomere. Neben grün-seifigen Noten besaßen die methylverzweigten Vertreter süßliche, zum Teil auch citrusartige Nuancen, die teils ins Metallische, Pfeffrige oder auch Würzig-Talgige übergingen. Zur Darstellung dieser methylverzweigten Fettaldehyde wurde eine rekombinant in E. coli exprimierte alpha-Dioxygenase aus dem Cyanobakterium C. subtropica eingesetzt, welche unter anderem hinsichtlich der Umsetzung iso- und anteiso-methylverzweigter Fettsäuren charakterisiert wurde. Dabei wurde festgestellt, dass die endständige Methylverzweigung keinen Einfluss auf die katalytische Effizienz und damit auf die Substratpräferenz hatte. Mittels Thermofluor-Assay, gaschromatographischer Methoden und Messung des Sauerstoff-Verbrauchs über eine optische Sonde wurden Salz-, pH- und Temperaturoptimum sowie das Substratspektrum und enzymkinetische Parameter bestimmt. Das Enzym zeichnete sich durch die für alpha-Dioxygenasen atypische Umsetzung verhältnismäßig kurzkettiger Substrate (< C14) und eine gewisse Halophilie aus. Mit diesem Enzym wurde erstmals eine alpha-Dioxygenase nicht-pflanzlichen Ursprungs beschrieben.
Keywords: Aldehyde; Aromastoffe; Biotechnologie; Geruchsschwellen; alpha-Dioxygenase; Carbonsäure-Reduktase; Crocosphaera subtropica; methylverzweigte Aldehyde; endständig ungesättigte Aldehyde; Pilzlipide; ddc:540