SorY und UpsM, funktionelle Charakterisierung zweier sRNAs in Rhodobacter sphaeroides - Weber, Lennart; Justus Liebig University Giessen (My University, 2017)
Das Bakterium Rhodobacter sphaeroides kann anoxygene Photosynthese betreiben und ist in Gegenwart von Licht und Sauerstoff der Bakteriochlorophyll a abhängigen Bildung von Singulettsauerstoff (1O2) bzw. photooxidativem Stress ausgesetzt. Bisherige Arbeiten beschäftigten sich eingehend mit der Regulation der photooxidativen Stressantwort. Hierbei lag der Fokus zunächst auf der transkriptionellen Genregulation, die hauptsächlich durch alternative Sigmafaktoren (RpoE, RpoHI/II) vermittelt wird und bereits beschrieben wurde. Zum vollständigen Verständnis der Stressantwort ist es wichtig, auch die posttranskriptionelle Genregulation durch sRNAs zu betrachten. Um diese Lücke zu schließen, wurden die trans-kodierten sRNAs SorY (RSs_1543) und UpsM (RSs_0682) in dieser Arbeit untersucht. SorY (singlet oxygen resistance RNA Y) wird unter diversen Stressbedingungen RpoHI/II abhängig exprimiert und vermittelt Resistenz gegen 1O2. Durch Transkriptomanalysen, Mutationsanalysen in vivo und Interaktionsstudien in vitro wurde die takP mRNA als Ziel-RNA von SorY identifiziert. Das takP Gen (RSP_0097) kodiert ein extrazytoplasmatisches Substratbindeprotein eines TRAP Transporters, der an der Malat Aufnahme beteiligt ist. Im Zuge der photooxidativen Stressantwort wird SorY RpoHI/II abhängig induziert, reguliert die Expression von TakP negativ und mindert somit die Malat Aufnahme. Gleichzeitig induziert RpoHII unter anderem die Transkription von Genen die Enzyme aus dem Pentose Phosphat Weg (PPP), Entner Doudoroff Weg (ED) und der Gluconeogenese kodieren, weil diese Stoffwechselwege antioxidatives NADPH generieren. SorY unterstützt diese Stoffwechsel-verschiebung zugunsten der NADPH Produktion durch Limitierung der Malat Aufnahme, weil Malat ein Intermediat des TCA Zykluses darstellt, indem große Mengen prooxidatives NADH entstehen. Dies stellt eine neue biologische Funktion einer sRNA in der photooxidativen Stressantwort dar.UpsM (upstream sRNA of mraZ) ist die abundanteste sRNA von R. sphaeroides. In der Gegenwart von 1O2 wird die Prozessierung des Transkriptes zu einem stabilen 3 Fragment konditionell induziert. Durch diverse Deletionsstämme konnte gezeigt werde, dass die Prozessierung im Zuge einer Hfq abhängigen Duplexbildung mit der sRNA RSs_0827 durch RNase E stattfindet. Die biologische Funktion der UpsM-RSs0827 Bindung konnte bisher nicht aufgeklärt werden, obwohl diverse Transkriptomstudien und phänotypische Untersuchungen mit einer UpsM Überexpression durchgeführt wurden. Mechanistisch stellt die Bindung jedoch das erste bekannte Beispiel einer sRNA-sRNA Interaktion dar, bei der keine der Transkripte einen Phagen- oder Prozessierungsursprung hat. Bei UpsM handelt es sich außerdem nicht, wie zunächst angenommen, um eine alleinstehende (orphan) IGR kodierte sRNA. Stattdessen entsteht die sRNA durch Transkriptionstermination an einem intrinsischen Terminator in einer außergewöhnlich langen 5 UTR (268 nt) von mraZ, die auch einen sORF enthält. mraZ ist das erste Gen des dcw (division and cell wall) Genclusters / Operons (16 Gene). Dcw Gene, deren Regulation und Position zueinander sind unter gram-negativen und stäbchenförmigen Bakterien stark konserviert und besonders in E. coli gut beschrieben. Trotzdem gibt es keine Bakterienspezies für die eine lange dcw 5 UTR mit intrinsischem Terminator bekannt wäre. Durch die Analyse von RNA Seq Daten konnte gezeigt werden, dass lange 5 UTRs upstream von mraZ nicht nur bei R. sphaeroides sondern generell in der Familie der Rhodobacteraceae zu finden sind. Zusätzlich sind Hinweise darauf zu finden, dass es sich bei der dcw 5 UTR von R. sphaeroides um einen riboswitch handeln könnte. Falls dies der Fall ist, wäre UpsM erst das zweite Beispiel einer riboswitch entstammenden sRNA mit nachgewiesener Funktion in trans.

Exposure to oxygen and light generates photooxidative stress by the bacteriochlorophyll a mediated formation of singlet oxygen (1O2) in the facultative photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides. The regulation of the photooxidative stress response on the transcriptional level mediated by alternative sigma factors (RpoE, RpoHI/II) is well understood. However sRNAs regulating on a posttranscriptional level to favor the stress response were not investigated that intensively. For a more complete elucidation of regulatory features during photooxidative stress the role of the trans-encoded sRNAs SorY (RSs_1543) und UpsM (RSs_0682) was characterized during this work. SorY (singlet oxygen resistance RNA Y) is an sRNA, which is induced under several stress conditions in RpoHI/II dependent manner and confers increased resistance against 1O2. The takP mRNA was identified to be its target mRNA. takP (RSP_0097) encodes a TRAP-T transporter involved in malate uptake. During photooxidative stress SorY, induced by RpoHI/II, regulates the TakP expression negatively and consequently limits malate uptake. Simultaneously enzymes for pentose phosphate pathway, Entner Doudoroff pathway and gluconeogenesis are induced by RpoHII to enhance production of the antioxidant NADPH. SorY contributes to this metabolic shift by limiting malate flux into the tricarboxylic acid cycle (TCA cycle), which produces large amounts of prooxidative NADH. This reflects a novel biological function of an sRNA in oxidative stress responses.UpsM (upstream sRNA of mraZ) is the most abundant sRNA of R. sphaeroides. Processing of UpsM to a stable 3 fragment is conditionally induced in the presence of 1O2. Several mutant strains revealed that RNase E facilitates this cleavage in the course of Hfq dependent duplex formation with the sRNA RSs_0827. It is not possible to speculate about the biological role of UpsM so far, since further mRNA target of UpsM or RSs_0827 remain unknown. However, UpsM and RSs0827 may represent the first example of an sRNA-sRNA interaction apart from rarely known examples of sRNAs, that are of phage origin or derive from processing. Furthermore, UpsM is not an orphan sRNA encoded in an IGR as initially assumed, but derives from transcriptional termination at an intrinsic terminator in an unexpected long 5 UTR of mraZ, which also encodes a sORF. MraZ is the first gene of the dcw (division and cell wall) gene clusters / operon. Dcw genes were intensively investigated. Their regulation and their relative order within the cluster are said to be outstandingly conserved among rod shaped and gram-negative bacteria. However a long 5 UTR has never been reported. Analysis of RNA seq data revealed the presence of such a long dcw 5 UTR with intrinsic terminator not only in R. sphaeroides but the whole family of Rhodobacteraceae, raising the question for its regulatory function. Therefore UpsM might represent the second described case of a trans acting sRNA derived from a riboswitch.
SorY and UpsM, functional characterization of two sRNAs in Rhodobacter sphaeroides
Keywords: ddc:570