Expression zytoskeletaler Filamente und des vascular endothelial growth factor (VEGF) systems in der endotheliochorialen Plazenta von Hund und Katze - Bezler, Linn; Justus Liebig University Giessen (My University, 2008)
Vascular endothelial growth factor (VEGF) ist einer der Hauptwachstumsfaktoren in Bezug auf die Angiogenese. Diese spielt für die plazentare Entwicklung und Morphogenese eine entscheidende Rolle, denn Plazentagewebe zeigt ein hohes Ausmaß an Angiogenese, ein Prozess, der für Gewebewachstum und Plazentamorphologie verantwortlich ist. Diese Arbeit befasste sich daher mit der räumlichen und zeitlichen Expression von VEGF und seinen beiden Rezeptoren Flt-1 (VEGFR-1) und Flk-1 (KDR, VEGFR-2) in der endotheliochorialen caninen und felinen Plazenta. Sie sollte über den Zusammenhang von Vaskularisierung, VEGF-Expression und dessen Rolle in der plazentaren Angiogenese der endotheliochorialen Plazenta von Hund und Katze Aufschluss geben. Von besonderem Interesse waren weiterhin das Invasionsverhalten der Trophoblastzellen und die Charakterisierung der Deziduazellen. Initial erfolgte eine Identifikation der Gewebekomponenten innerhalb der Plazenta durch die Analyse der Expression der zytoskeletalen Filamente alpha-sm-Actin, Vimentin und Zytokeratin. Der Nachweis von VEGF und seine Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2 in der caninen und felinen Plazenta erfolgte auf Protein- und mRNA-Ebene. Auf Proteinebene wurden die Immunhistochemie und der Western Blot eingesetzt, auf mRNA-Ebene die RT-PCR, Real Time RT-PCR und für VEGF zusätzlich die In situ Hybridisierung. Die untersuchten Plazenten stammen von insgesamt 23 Katzen und 43 Hunden und wurden im Rahmen von Kastrationen gesunder, trächtiger Tiere entnommen. Das Material wurde in Formalin fixiert und schockgefroren beziehungsweise in RNAlater® überführt. Das Probenmaterial deckte den gesamten Zeitraum der Trächtigkeit ab, von der frühen Gravidität bis unmittelbar vor den Geburtseintritt. Die drei eingesetzten Antikörper gegen die Zytoskelettfilamente (alpha-sm Actin, Vimentin und Zytokeratin) zeigten im Verlauf der Trächtigkeit keine Unterschiede in der zeitlichen und räumlichen Expression. Die generelle Verteilung von alpha-sm Actin, Vimentin und Zytokeratin änderte sich also im Verlauf der Gravidität nicht. Zytokeratin wurde vor allem zur Identifikation der invadierenden Trophoblastzellen eingesetzt und war dementsprechend in den Trophoblastzellen sowie im Epithel der Drüsen lokalisiert. alpha-sm Actin konnte im Myometrium, in den Endothelzellen der fetalen Kapillaren und in maternalen Gefäßwänden sowie in den Deziduazellen und Periendothelzellen nachgewiesen werden. Vimentin färbte das fetale und maternale Gefäßendothel sowie die Periendothelzellen beziehungsweise die Deziduazellen mit hoher Intensität. VEGF und seine Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2 konnten während der gesamten Gravidität in der caninen und felinen Plazenta detektiert werden. Dabei zeigte die immunhistochemische Färbung eine annähernd identische räumlich-zeitliche Verteilung von VEGF, Flt-1 und KDR. Das komplette VEGF Ligand-Rezeptor-System konnte auf maternaler Seite im Myometrium, in den Drüsenepithelien und in den Deziduazellen nachgewiesen werden, auf fetaler Seite in den Trophoblastzellen sowie in den fetalen Kapillaren und Mesenchymzellen. Die Endothelzellen der maternalen Gefäße zeigten eine deutliche Immunreaktion für VEGF und besonders für Flt-1, wohingegen KDR in den maternalen Gefäßen des Plazentarlabyrinths meist keine Immunreaktion hervorrief, dafür aber in den Endothelien der großen maternalen Arterien in der Invasionszone. Sowohl im Plazentahomogenat der Katze als auch in dem des Hundes konnten VEGF und seine Rezeptoren mittels Western Blot nachgewiesen werden. Auch auf der mRNA-Ebene konnten VEGF, Flt-1 und KDR in jedem untersuchten Trächtigkeitsstadium ermittelt werden. Bei der Real Time RT-PCR stellte sich heraus, dass das Expressionsniveau von VEGF in der frühen Gravidität am höchsten war und bis zum Ende der Gravidität kontinuierlich sank. Die Expression von Flt-1 fand in den ersten beiden Graviditätsdritteln auf eher niedrigem Niveau statt und stieg dann am Ende der Gravidität hoch-signifikant (p=0,0014) an. Die Flk-1 mRNA-Expression dagegen war in den frühen Stadien der Gravidität und am Ende der Gravidität niedrig, mit einem signifikanten Anstieg (p<=0,05) in der Gestationsmitte. Für VEGF wurde bei der In situ Hybridisierung sowohl auf maternaler als auch auf fetaler Seite ein der IHC entsprechendes Expressionsmuster der VEGF-mRNA festgestellt. Somit konnten VEGF und seine Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2 in dieser Studie erstmalig erfolgreich in der endotheliochorialen Plazenta von Hund und Katze nachgewiesen werden. Die Lokalisation von VEGF in den Endothelien der plazentaren Gefäße sowie in den fetalen Mesenchymzellen spiegelt die Involvierung von VEGF in direkte angiogene Prozesse während der Plazentation von Hund und Katze wieder. Die Expression von VEGF in nicht-endothelialen Zellpopulationen wie dem Trophoblasten deutet darauf hin, dass VEGF zudem autokrin die Trophoblastenfunktion beeinflussen kann oder parakrin auf benachbarte Zellen einwirken kann. Die Anwesenheit von VEGF in den Deziduazellen und Periendothelzellen sowie deren Lokalisation im Gewebe lässt den Schluss zu, dass sie in die Regulation des lokalen plazentaren Blutflusses und zudem in die Kontrolle der Trophoblasteninvasion involviert sind. Des weiteren könnte VEGF eine Rolle in der Entwicklung und Differenzierung der Deziduazellen spielen. Abschließend kann also davon ausgegangen werden, dass das VEGF Ligand-Rezeptor-System in der Regulation der caninen und felinen Plazentation partizipiert und zusätzlich zu seinen angiogenen Eigenschaften beeinflusst es vielleicht die Zelldifferenzierung und Sekretionseigenschaften im Drüsenepithel sowie die Zelldifferenzierung und Invasionseigenschaften des Trophoblasten.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) represents one of the major growth factors inreference to angiogenesis. The high degree of angiogenesis in placental tissues plays an essential role for placental development and morphogenesis. The placental neovascularization is a physiological process which is characterized by an initial dramatic increase of blood vessels through angiogenesis (the development of new blood vessels from pre-existing vessels) on the maternal site and vasculogenesis (de novo formation of new capillaries from the embryonic mesenchyme) on the fetal site. Therefore this study was conferred with the spatiotemporal expression of VEGF and its two receptors Flt-1 (VEGFR-1) and Flk-1 (KDR, VEGFR-2) in the canine and feline placenta. The aim of the study was to gain further insight into the relation of vascularization, VEGF-expression and its role in the placental angiogenesis in the endotheliochorial placenta of dog and cat. Furthermore the invasive behaviour of the trophoblast and the characterization of the decidual cells have been of special interest. The first target of this research was the identification of the tissue components within the placenta. Therefore we analyzed the expression of the micro- and intermediate filaments alpha-sm actin, cytokeratin and vimentin. The detection of VEGF and its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 in the canine and feline placenta occurred on protein and mRNA levels. Protein was analyzed by immunohistochemistry and western blot, mRNA was analyzed by RT-PCR, Real Time RT-PCR and in situ hybridization. The examined placentas were taken from 23 cats and 43 dogs, through castrations of healthy, pregnant animals. The material was fixed in formalin and shock-frozen in liquid nitrogen or transferred in RNAlater®. The tissue samples covered the whole period of gestation, from early gestation to immediately prepartum. The three antibodies against the cytoskeletal filaments alpha-sm actin, cytokeratin and vimentin showed no differences in the spatiotemporal expression throughout pregnancy. So the general distribution of alpha-sm actin, cytokeratin and vimentin have presented no change in the course of gestation. Cytokeratin was used to identify the invading trophoblast and was therefore localized in the trophoblast cells and in the epithelial cells of the glands. alpha-sm actin was detected in the myometrium, the endothelial cells of the fetal capillaries, in the maternal vessel walls and in the decidual cells and periendothelial cells. Vimentin stained the fetal and maternal endothelium and the decidual cells or respectively periendothelial cells with high intensity. VEGF and its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 could be detected in the canine and feline placenta throughout the whole period of gestation. Thereby the immunohistochemical staining showed an approximately identical spatiotemporal distribution for VEGF, Flt-1 and KDR. On the maternal site the whole VEGF ligand-receptor-system could be detected in the myometrium, the epithelial cells of the glands and in the decidual cells. On the fetal site it was localized in the trophoblast cells as well as in fetal capillaries and mesenchymal cells. Whereas the endothelial cells of the maternal vessels showed a distinct immunoreactivity for VEGF and especially for Flt-1, KDR did not evoke an immunoreactivity in the maternal vessels of the placental labyrinth, but in the endothelium of the big maternal arteries in the invasive zone. To verify the results of the immunohistochemistry, a western blot was accomplished on protein level. VEGF and its receptors could be detected in the feline placental homogenate as well as in the canine placental homogenate. Item on mRNA level VEGF, Flt-1 and KDR could be acquired in each of the examined gestational stages. The Real Time RT-PCR showed that the expression of VEGF was highest in early gestation and decreased continuously until term. The expression of Flt-1 was on a low level in the first and second gestational trimester and increased very significant (p=0,0014) at the end of gestation. In contrast, the KDR mRNA-expression was low in the early stages of gestation and near term, with a significant increase (p<=0,05) in the mid gestation. The in situ hybridization displayed an expression pattern for VEGF accordingly to that of the immunohistochemistry, both on the maternal and the fetal site. As result of this study, VEGF and its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 could be detected successfully in the endotheliochorial placenta of dog and cat for the first time. The localization of VEGF in the endothelial cells of the placental vessels as well as in fetal mesenchymal cells, reflected the involvement of VEGF in direct angiogenic processes during the placentation of dog and cat. The expression of VEGF in non-endothelial cell populations like the trophoblast, indicates that the VEGF system may influence trophoblast function in an autocrine manner or act on neighbouring cells in a pracrine manner. The presence of VEGF in decidual cells or periendothelial cells as well as their localization in the tissue, suggest that they are involved in the regulation of local placental blood flow and in the control of trophoblast invasion. Furthermore, VEGF could play a role in the development and differentiation of decidual cells. In conclusion, we assume that the VEGF ligand-receptor-system participates in the regulation of canine and feline placentation, and in addition to its angiogenic properties it may influence cell differentiation and secretion properties in the gland epithelium as well as in cell differentiation and invasion properties in the trophoblast.
Keywords: ddc:630