Schnelle und einfache Bestimmung der Genotypen des Hepatitis B Virus durch eine Multiplex-PCR - Kirschberg, Oliver; Justus Liebig University Giessen (My University, 2002)
Das Ziel der Arbeit war es eine einfache und zeitsparende Methode zu etablieren, die in der Lage war, die heute bekannten siebenGenotypen des Hepatitis B Virus zu erkennen. Zu Beginn der Arbeit wurde versucht eine publizierte Methode zu verbessern. Bei derverwendeten Multiplex-PCR wurden die HBV-Genotypen A, C, D und F diskriminiert. Nach unveröffentlichten Ergebnissen sollte auch nochder Genotyp E erkannt werden. Um diese Multiplex-PCR zu verbessern, wurde ein spezifischer Primer für den Genotypen B getestet. Zwargelang der spezifische Nachweis eines Genotyp-B-Isolates wodurch alle zum damaligen Zeitpunkt bekannten Genotypen A-F in einerMultiplex-PCR nachweisbar waren; aber die Methode erwies sich für die Routinediagnostik als zu störungsanfällig. Deshalb wurde mit einem etwas anderen methodischen Ansatz eine neue Multiplex-PCR entwickelt, die in einem Reaktionsansatz dieheute gängigen sieben HBV-Genotypen zu differenzieren vermochte. Mit Hilfe verschiedener Computerprogramme wurden siebenPrimerpaare entwickelt, die die gleiche vorhergesagte Annealingtemperatur aufwiesen. In umfangreichen Experimenten wurden dann dieverschiedenen Parameter wie Annealing- und Elongationstemperaturen, Zykluszeiten, verschiedene Thermocycler sowie verschiedenehitzestabile Polymerasen optimiert. Unter den gefundenen Bedingungen erwies sich die Multiplex-PCR als hochspezifisch. EineGenotypisierung gelang nicht nur mit HBV-DNA haltigen Plasmiden, sondern auch in einer kleinen Auswahl von Patientenseren mit durchSequenzierung bekanntem Genotyp. Auch die Empfindlichkeit des System war mit 103-104 Genomäquivalenten pro ml befriedigend. Nunmehr steht ein System zur Verfügung, welches seinem Ziel - der einfachen und schnellen HBV-Genotypisierung gerecht wird.
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