Aufklärung der Rolle viraler Proteine für die Entstehung und Progression papillomvirusinduzierter Tumoren im Kaninchenmodell - Jeckel, Sonja; Justus Liebig University Giessen (My University, 2003)
Die intrakutane Infektion von Hauskaninchen mit dem Cottontail rabbit Papillomavirus (CRPV) verursacht lokal gutartige Hauttumoren (Papillome), die zu über 80% innerhalb von sechs bis vierzehn Monaten zu invasiv wachsenden Karzinomen progredieren, ohne dass weitere Kofaktoren dazu nötig sind. Somit ist das Hauskaninchen ein geeignetes Tiermodell zur Aufklärung der molekularen Vorgänge bei der Entstehung und Progression kutaner papillomvirusinduzierter Tumoren. Der zentrale Regulator der Transkription der viralen Onkogene und der viralen DNA-Replikation ist das frühe E2-Protein. Eine genetische Trennung dieser beiden Funktionen ist bei BPV 1, HPV 11, 16, 18 und 31 durch Mutation der hochkonservierten Aminosäuren 37, 39 oder 73 möglich. Analoge Mutationen wurden in CRPV-E2 eingeführt und zeigten das gleiche Verhalten. So führte Mutation der Aminosäure 37 oder 73 zu einem Verlust der Transaktivierungseffizienz in Reporterassays im Vergleich zu Wildtyp-CRPV-E2 bei erhaltener Replikationseffizienz. Mutation der Aminosäure 39 von CRPV-E2 hatte den umgekehrten Effekt, bei erhaltener Transaktivierungsfunktion lag ein Verlust der Replikationseffizienz in transienten Replikationsassays vor. Neben dem Transkript für das vollständige E2-Protein ist bei BPV 1, HPV 11, 16, 31 und 33 ein alternativ gespleißtes E2-Transkript bekannt, dessen Translationsprodukt (E8^E2C) einen E2-Repressor darstellt. Ein entsprechendes Transkript konnte mittels RT-PCR aus CRPV-induzierten Papillomen und Karzinomen verschiedener Kaninchen isoliert werden und wurde E9^E2C genannt. E9^E2C inhibierte konzentrationsabhängig die Transaktivierungsaktivität von CRPV-E2 in Reporterassays und die E2-abhängige transiente Replikation des CRPV-Replikationsursprungs. Zudem reprimierte E9^E2C die Basalaktivität verschiedener Reporterkonstrukte in drei unterschiedlichen Zelllinien. Um die in vivo Bedeutung dieses Repressorproteins und der Transaktivierungsdomäne von CRPV-E2 auf Tumorentstehung und progression zu untersuchen, wurden Mutationen in das CRPV-Gesamtgenom eingeführt. Diese Mutanten-DNAs wurden ebenso wie Wildtyp-CRPV-DNA mittels Partikel-vermitteltem DNA-Transfer mit der 'Helios gene gun' in die Haut von Hauskaninchen eingebracht. Mutation der Aminosäure 37 oder 73 in CRPV-E2 führte dabei zu einem fast vollständigem Verlust der Tumorinduktion, während 93% aller mit Wildtyp-CRPV-DNA injizierten Stellen eine Papillomentstehung innerhalb von sechs Wochen vorweisen konnten. Hingegen zeigten zwei verschiedene knock-out Mutationen in E9 im gesamtgenomischen Kontext von CRPV keinen Unterschied im Vergleich zu Wildtyp-CRPV-DNA bezüglich Tumorentstehung, -progression, CRPV-Kopienzahl, physikalischem Status der DNA und CRPV-Transkriptmengen. Während die Transaktivierungsdomäne in CRPV-E2 vermutlich essentiell für die Tumorentstehung ist, und damit ein mögliches Ziel für Therapien gegen papillomvirusinduzierte Tumoren darstellt, ist die in vivo Bedeutung des CRPV-E9^E2C-Repressorproteins weiterhin unbekannt und erfordert weitere Untersuchungen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war ein Therapieversuch mit zwei unterschiedlichen Polyphenol-Formulierungen. Polyphenole sind der Hauptbestandteil von grünen Tee-Extrakten. Sie zeigten in früheren Untersuchungen ein weites Spektrum an pharmazeutisch interessanten Aktivitäten wie anti-tumorigene, anti-karzinogene u.a. Eigenschaften. Die CRPV-induzierten Hauttumoren beim Hauskaninchen dienten hier als Modell für papillomvirusinduzierte gutartige Tumoren beim Menschen. Trotz achtwöchiger, fast täglicher Behandlung konnte in diesem Versuch keine Wirkung der Polyphenole auf die Tumoren nachgewiesen werden. Es wäre wünschenswert, die Wirksamkeit polyphenolhaltiger Therapeutika gegen CRPV-induzierte Hauttumoren in einem wiederholten Versuch mit modifiziertem Versuchsaufbau erneut zu untersuchen.

Intracutaneous infection of domestic rabbits with the cottontail rabbit papillomavirus (CRPV) causes local benign skin tumors (papillomas) which progress to carcinomas in more than 80% of cases within six to fourteen months without the need of any cofactors. This animal model system therefore allows the identification of molecular mechanisms required for the induction and progression of epithelial papillomavirus-induced tumors. The early viral E2 protein is the central regulator of both viral DNA replication and transcription of viral oncogenes. These functions can be genetically separated in BPV1, HPV 11, 16, 18 and 31 by mutation of the highly conserved amino acids 37, 39 or 73. Respective mutations were introduced into CRPV-E2 and found to behave correspondingly. Mutation of the amino acid 37 or 73 resulted in a loss of the transactivation activity in reporter assays compared to wild type E2 whereas the replication efficiency was maintained. Mutation of the amino acid 39 in CRPV E2 had the oppositeeffect, the protein was transactivation competent but replication deficient in transient replication assays. Aside from the transcript for the full length E2 protein an alternatively spliced E2 transcript is known in BPV 1, HPV 11, 16, 31 and 33 whose translation product (E8^E2C) is an E2 repressor protein. A comparable transcript was isolated from CRPV-induced papillomas and carcinomas of different rabbits by RT-PCR and designated E9^E2C. E9^E2C inhibited the transactivation activity of CRPV-E2 in reporter assays and the E2-dependent transient replication of the CRPV-origin in a concentration dependent manner. Additionally, E9^E2C repressed the basal activity of different reporter constructs in three cell lines. In order to investigate the importance of this repressor protein and of the transactivating domain of CRPV-E2 on tumor induction and progression in vivo, mutations were introduced into the whole genome of CRPV. These mutant DNAs as well as wild type CRPV-DNA were injected into the skin of domestic rabbits by particle-mediated DNA transfer with the 'Helios gene gun'. Strikingly, the ability to induce tumors within six weeks was almost abolished by mutation of the amino acid 37 or 73 of CRPV-E2, in contrast to the tumor induction rate (93%) obtained with wild type CRPV-DNA. In comparison to wild type CRPV-DNA two different knockout mutations of E9 within the CRPV genome showed no difference regarding tumor induction, progression, CRPV copy number, physical status of the DNA and amount of CRPV transcripts. The transactivating domain of CRPV-E2 seems to be essential for tumor induction and therefore represents a possible target for therapies against papillomavirus-induced tumors, in contrast the in vivo importance of the CRPV-E9^E2C repressor protein remains to be determined. Two different formulations of polyphenols were used in a therapy trial. Polyphenols are the main components in extracts from green tea and they are known to have a number of pharmaceutically interesting properties like anti-tumorigenic and anti-carcinogenic activities. The CRPV-induced tumors in the domestic rabbit served as model for benign papillomavirus-induced tumors in men. In spite of an almost daily treatment for eight weeks no effect of the polyphenols on tumor growth could be demonstrated in this experiment. A further experiment with modified experimental conditions is recommended to investigate the efficacy of polyphenols on CRPV-induced tumors.
The role of viral proteins in the induction and progression of papillomavirus-induced tumors in domestic rabbits
Keywords: Papillomvirus; CRPV; Repressor; Tumorentstehung; papillomavirus; CRPV; ddc:630