Identifizierung von Membranproteinen in der apikalen Plasmamembran und in Aposomen der Koagulationsdrüse der Ratte - Post, Heidi; Justus Liebig University Giessen (My University, 2004)
In der Koagulationsdrüse (KD) der Ratte findet ein alternativer Exportmechanismus zur merokrinen Sekretion statt, die apokrine Sekretion. Proteine, die kein N-terminales Signalpeptid für die Translokation in das endoplasmatische Retikulum (ER) besitzen, werden von den KD-Epithelzellen (KDE-Zellen) an zytoplasmatischen Polyribosomen translatiert und in sog. Aposomen, die aus der apikalen Plasmamembran entstehen, aus der Zelle ausgeschleust. Bislang ist nicht bekannt, welche Proteine Bestandteil der apikalen Plasmamembran sind und ob diese in die Aposomen integriert werden. Die humane Prostata exportiert über einen ebenfalls alternativen Exportmechanismus Proteine mittels sog. Prostasomen. Einige dieser Prostasomenproteine, darunter eine Ca2+-ATPase (PMCA), eine Alkalische Phosphatase (AP) und eine Neutrale Endopeptidase (NEP), sind bereits bekannt. Das zentrale Anliegen dieser Arbeit bestand in der Identifizierung von Proteinen der apikalen KD-Epithel- bzw. der Aposomenmembran. Im KD-Epithel und in den Aposomen konnten eine Mg2+-abhängige und eine Mg2+-unabhängige Ca2+-ATPase sowie einer AP identifiziert werden. Die Expression der NEP konnte durch Reverse-Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) nur auf der Ebene der messenger Ribonukleinsäure (mRNA) gezeigt werden. Im Einzelnen wurden folgende Ergebnisse erzielt: Die mRNA der Plasmamembran-Ca2+-ATPase (PMCA) der Isoformen 1 und 4 konnte in KDE-Zellen und KD detektiert werden. In Mikrosomenfraktionen aus KDE-Zellen und KD ließen sich im Western Blot die Proteine PMCA1 und PMCA4 nachweisen. PMCA1 konnte durch immunhistochemische Methoden im apikalen und basalen Bereich der KDE-Zellen, in der apikalen Membran des KD-Epithels und in Aposomen nachgewiesen werden. PMCA4 konnte nur schwach in den KDE-Zellen und vorwiegend im Stroma des KD-Gewebes lokalisiert werden. Zusätzlich wurde die Mg2+ abhängige und Mg2+ unabhängige Ca2+-ATPase-Aktivität in Mikrosomen von KDE-Zellen, KD und in KD-Sekret, das die Aposomen enthält, bestimmt. Die Aktivität war durch Calmodulin stimulierbar und durch Trifluorperazin, Nifedipin und Verapamil konzentrations-abhängig hemmbar. Nach Ultrazentrifugation des KD-Sekretes war die Enzymaktivität auf das Pellet beschränkt, was auf die Membranständigkeit (Aposomen) des Enzyms schließen lässt. Es konnte gezeigt werden, dass die Gen- und Proteinexpression der PMCA androgenabhängig reguliert wird. Auf Gewebeschnitten der KD von kastrierten Tieren ließ sich PMCA1 im Gegensatz zum Kontrolltier nicht in der apikalen Plasmamembran bzw. den Aposomen detektieren. Versuche zur Stimulation von KDE-Zellen mit Dihydrotestosteron (DHT) in Konzentrationen von 10-8 bis 10-6 M führten tendenziell zu einer erhöhten Transkriptionsrate der PMCA1-mRNA, wogegen DHT auf die PMCA4-mRNA-Menge keinen sichtbaren Effekt zeigte. Die Aktivität der Mg2+-abhängigen und Mg2+-unabhängigen Ca2+-ATPase wurde bei einer mittleren DHT-Konzentration von 10-7 M am stärksten gesteigert. In Mikrosomen aus KDE-Zellen, KD und in KD-Sekret wurde ebenfalls eine AP-Aktivität detektiert. Nach Ultrazentrifugation des KD-Sekretes war die AP-Aktivität nicht auf die Membranfraktion beschränkt, sondern die AP lag zu 50 % gelöst und zu 50 % membrangebunden im Sekret vor. Histochemische Untersuchungen lokalisierten die AP-Aktivität auf KDE-Zellen und an Gewebeschnitten hauptsächlich auf der basalen und vereinzelt auf der apikalen Seite des KD-Epithels. Durch Untersuchungen der Hitzestabilität des Enzyms und durch anschließende RT-PCR wurde die gewebeunspezifische Isoform der AP identifiziert und bestätigt. Stimulationsversuche mit DHT ließen keine eindeutige Aussage über die Androgenabhängigkeit der AP in den KDE-Zellen zu. Das zentrale Anliegen dieser Arbeit, Proteine zu identifizieren, die sowohl Bestandteil des apikalen KD-Epithels als auch der Aposomenmembran sind, konnte teilweise erreicht werden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass PMCA1 sowohl im apikalen KD-Epithel als auch in den Aposomen nachzuweisen ist. Die Untersuchungen zur AP weisen auf einen Export des Enzyms aus den KDE-Zellen sowohl an Aposomen gebunden als auch in freier Form hin. Eine endgültige Aussage zur Lokalisation des Enzyms in den KDE-Zellen bzw. den Aposomen war jedoch mangels eines spezifischen Antikörpers nicht möglich. Caveolin-1 konnte weder im apikalen KD-Epithel noch in den Aposomenmembranen identifiziert werden.
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