Charakterisierung des Invasionsmechanismus des Virus der bovinen viralen Diarrhöe (BVDV) - Krey, Thomas; Justus Liebig University Giessen (My University, 2004)
Der Invasionsmechanismus von BVDV wurde unter besonderer Berücksichtigung des Penetrationsmechanismus und der Charakterisierung der CRIB-Zellen untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1.) Mittels verschiedener biomechanischer (Dynamin), chemischer (Chlorpromazin und ß-Methylcyclodextrin) und biophysikalischer (intrazelluläre K+-Depletion und Hyperosmolarität) Inhibitionsmethoden wurde die Rolle der rezeptorvermittelten Endozytose bei der Invasion von BVDV untersucht. Jede dieser Methoden führte zu einer Hemmung der BVDV Infektion. Damit wurde eindeutig gezeigt, daß BVDV mittels rezeptorvermittelter Endozytose in die Wirtszelle aufgenommen wird. Obwohl keine dieser Methoden spezifisch ausschließlich die Clathrin-abhängige Endozytose hemmt, spricht die Kombination dieser Ergebnisse dafür, daß es sich bei der Internalisierung von BVDV um Clathrin-abhängige Endozytose handelt. 2.) BVDV benötigt einen saures endosomales Milieu für eine Infektion, zeigt aber keine Empfindlichkeit gegenüber niedrigen pH-Werten, wie es für andere endosomal aufgenommene, behüllte RNA-Viren beschrieben ist. Diese pH-Stabilität war in Kombination mit einer Reduktion der viralen Disulfidbrücken deutlich abgeschwächt. Zusätzlich wurde gezeigt, daß BVD Virionen nach erfolgter Adsorption nur in Anwesenheit reduzierender Substanzen mit der Zellmembran fusionieren konnten. Damit konnte der Gegensatz von pH-Stabilität und pH-Abhängigkeit auf eine mögliche Stabilisierung des Virions durch intermolekulare Disulfidbrücken der viralen Glykoproteine zurückgeführt werden. Diese Stabilisierung stellt einen fundamentalen Unterschied zu den Invasionsmechanismen anderer behüllter RNA-Viren dar. 3.) Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen bewiesen, daß bCD46CRIB als zellulärer Rezeptor für BVDV funktionell ist und damit als Ursache der Resistenz der CRIB-Zellen nicht in Frage kommt. Die Existenz und Funktion des LDL-Rezeptors in CRIB-Zellen wurde ebenfalls nachgewiesen und damit als Ursache der Resistenz ausgeschlossen. Mittels Bindungs- und Internalisierungstests wurde gezeigt, daß CRIB-Zellen signifikant weniger BVD Virus binden können als MDBK-Zellen und kein BVDV internalisieren. MDBK-Zellen, deren Vesikelabschnürung blockiert war, zeigten ein identisches Internalisierungsprofil wie CRIB-Zellen. Die vermutliche Lokalisation der für den Phänotyp der CRIB-Zellen verantwortlichen Mutation konnte damit auf die Zellmembran eingeschränkt werden.

The invasion of BVDV was analysed with focus on the mechanism of penetration and the characterization of CRIB-cells. The following results were obtained: 1.) The role of receptor-mediated endocytosis in BVDV invasion was determined by different biomechanical (dynamin), chemical (chlorpromazine and ß-methyl-cyclodextrin) and biophysical (intracellular potassium depletion and hyperosmolarity) inhibition methods. Each method resulted in an inhibition of BVDV infection of MDBK cells, which clearly shows, that BVDV is internalized into host cell by receptor-mediated endocytosis. Although none of these methods exclusively affect clathrin-dependent endocytosis, in combination these data strongly suggest that internalization of BVDV into host cell is a clathrin-dependent process. 2.) BVDV requires an acidic endosomal environment to infect host cells, but at the same time BVDV exhibits no sensitivity to low pH-exposure. This sensititivity is typical for other enveloped RNA-viruses using receptor-mediated endocytosis. The pH-stability of BVDV was decreased by reducing agents. Adsorbed BVD virions can fuse pH-dependently with the cellular membrane only in the presence of reducing agents. Likely the virion is stabilized by intermolecular disulfide bridges of the viral glycoproteins. This stabilization constitutes a fundamental difference to the invasion mechanisms of other enveloped RNA-viruses. 3.) Molecular and biochemical analysis of bCD46CRIB revealed, that the molecule can act as a functional cellular receptor for BVDV and thus can be ruled out as the causal mutation of the resistance of the CRIB-cells. The presence and function of the LDL-receptor in CRIB-cells was demonstrated, indicating that the LDL-receptor is not the reason for the resistance as well. By the use of binding and internalization assays CRIB-cells were shown to bind significantly lower amounts of BVD virus than MDBK-cells and to be unable to internalize BVDV. MDBK-cells, in which endosome formation is blocked, with respect to BVDV internalization behave like CRIB-cells. The mutation responsible for the phenotype of CRIB-cells is likely localized at the plasma membrane.
Keywords: ddc:630