Analyse der Promotorregulation und des Effekts humaner genetischer Varianten auf die Expression der DNA-Glykosylase MUTYH - Köger, Nicole; Justus Liebig University Giessen (My University, 2017)
Die Adenin-DNA-Glykosylase MUTYH (humanes MutY Homolog) ist an der Korrektur von fehlgepaartem Adenin (A) gegenüber der oxidativ geschädigten Base 7,8-Dihydro-8-Oxoguanin (8-oxoG) beteiligt. Wird Adenin aus einer 8-oxoG:A-Basenpaarung vor einer nachfolgenden Replikationsrunde nicht entfernt, so entstehen somatische G:C> T:A Transversionsmutationen. Inaktivierende Keimbahnmutationen des MUTYH-Gens können zu kolorektalen Polypen und der Entwicklung von Darmkrebs führen. Dieses autosomal-rezessiv vererbbare Krankheitsbild wird als MUTYH-assoziierte Polyposis (MAP) bezeichnet und ist für etwa 1% aller Darmkrebserkrankungen ursächlich.Die Diagnose der MAP kann nur durch den Nachweis biallelisch inaktivierender Mutationen erfolgen. Das Problem hierbei ist, dass etwa drei Viertel der gefundenen Veränderungen in MUTYH als variants of uncertain significance (VUS) gelten. Bei diesen VUS ist nicht geklärt, ob sie das Gen inaktivieren und somit pathogen sind oder nicht. Dadurch können Träger solcher Mutationen keine eindeutige Diagnose und somit keinen Zugang zu Vorsorgeprogrammen erhalten. Das MUTYH-Gen ist durch drei alternative erste Exons (AFE) 1& alpha;, 1& beta; und 1& gamma; sowie starkes alternatives Spleißen gekennzeichnet. Die unterschiedlichen Transkripte führen zu verschiedenen Proteinisoformen, welche gewebeabhängig in die Mitochondrien oder den Nukleus transportiert werden. Wie dieser Vorgang durch den Promoter reguliert wird, ist bisher unklar. Des Weiteren ist der Einfluss einzelner, veränderter Nukleotide im MUTYH-Promoter von Polyposis-Patienten auf die Transkription des Gens unbekannt. Um dies zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit ein MUTYH-Promotor-Minigenmodell entwickelt, welches neben dem putativen Promotorbereich die alternativen ersten Exons sowie Exons 2-4 enthielt. Um regulative Sequenzmotive zu finden, wurde die Konservierung der Promotorregion ermittelt und konservierte Bereiche im Minigen inaktiviert. Zudem wurden sechs Patientenmutationen in das Minigen eingefügt, um nach transienter Transfektion deren Effekte auf die Transkription zu untersuchen. Dabei konnten drei regulatorische Sequenzmotive ausfindig gemacht werden, die für die korrekte Transkription der alternativen Isoformen von Bedeutung sind: das M4-Motiv, das Transkriptionsfaktor TFIIB Erkennungselement (BRE) und die GC-Box. Zusätzlich wurde der Einfluss der Transkriptionsfaktoren Sp1 und p53 auf die Transkription von MUTYH analysiert. Für keinen der Faktoren konnte jedoch ein Effekt in Bezug auf die Transkription der AFEs nachgewiesen werden. Für drei Patientenvarianten wurde keine Pathogenität ermittelt, während sich für drei weitere Varianten eine Einschränkung des Transkriptionslevels zeigte. Somit konnte in dieser Arbeit das MUTYH-Promotor-Minigen als humangenetisches, diagnostisches Werkzeug etabliert werden, welches auch in Zukunft für die Untersuchung von Patientenvarianten im Promotorbereich eingesetzt werden kann. In einem weiteren Teil der vorliegenden Arbeit wurden 29 unklare Varianten des missense Typs anhand der Proteinexpression, der Konservierung der ausgetauschten Aminosäure und mit Hilfe eines erstellten Homologiemodells des MUTYH-Proteins klassifiziert. 17 Varianten stellten sich dabei als wahrscheinlich pathogen heraus. Bei acht Varianten blieb die Pathogenität unklar , währenddessen vier der untersuchten VUS als wahrscheinlich nicht pathogen eingeordnet wurden. Diese Klassifizierungsdaten können Humangenetikern bei der Beurteilung von unklaren Varianten und der Entscheidung helfen, ob Betroffene regelmäßige Vorsorgeuntersuchungen erhalten sollten oder nicht.

The adenine DNA glycosylase MUTYH (human homolog of MutY) corrects mispaired adenine (A) bases opposite the oxidatively damaged base 7,8-dihydro-8-oxo-guanine (8-oxoG). If the mispaired adenine is not removed from 8-oxoG:A prior to replication, somatic G:C> T:A transversion mutations will arise. Inactivating germline mutations of the MUTYH gene can lead to colorectal polyposis and cancer. This autosomal recessive inheritable disease is called MUTYH-associated polyposis (MAP) which is causative for up to 1% of all colorectal cancers.MAP can only be diagnosed after the confirmation of biallelic inactivating mutations in the gene. The problem is that approximately three quarters of genetic variants found in polyposis patients are of uncertain significance (VUS). It is not clear whether these VUS inactivate the gene and are pathogenic or not. Thus, carriers of such mutations can neither get a final diagnosis nor have the opportunity for preventive medical checkups. The MUTYH gene contains three alternative first exons (AFE) 1& alpha;, 1& beta; and 1& gamma; and shows strong alternative splicing, generating multiple transcript variants encoding different protein isoforms which are either targeted to the mitochondria or to the cell nucleus depending on the tissue. So far, it is not known how this differential expression is regulated by the promoter. Moreover, the potential influence of single nucleotide alterations located in the MUTYH promoter from polyposis patients is not yet investigated. To analyze this, a minigene model consisting of the putative MUTYH promoter region, the three AFEs and exons 2-4 was generated. To be able to find important functional sequences, the conservation of the MUTYH promoter region was assessed and highly conserved areas of the MUTYH promoter were then inactivated in the minigene. In addition, to study the effect of patient mutations on MUTYH AFE transcription, human variants were introduced into the minigene. Overall, three regulatory motifs in the MUTYH promoter sequence were identified that are important for the correct transcription of the AFEs: the M4 motif, the transcription factor IIB recognition element (BRE) and the GC box. In this context, the impact of the transcription factors Sp1 and p53 was also examined, but there was no effect concerning the AFE transcription. For three of the studied patient variants no pathogenicity could be detected, whereas the other half of variants showed a reduction in their transcriptional level. In this work, a MUTYH minigene model was established that can be used as a genetic and diagnostic tool to analyze patient VUS in the MUTYH promoter region. Another part of this dissertation comprised the classification of 29 unclear missense variants. Patient variants were classified on the basis of protein expression analyses, conservation analyses of the amino acid substitutions and with the help of a homology model of the MUTYH protein. 17 variants were categorized likely pathogenic . Four tested patient variants were classified likely non-pathogenic and for eight variants the pathogenicity remained unclear . Taken together, these classification data can help human geneticists to decide whether a patient should receive regular medical checkups or not.
Analysis of promoter regulation and the effect of human genetic variants on the expression of the DNA glycosylase MUTYH
Keywords: MUTYH; DNA-Glykosylase; BER; MUTYH; dna glycosylase; BER; ddc:570