Nachweis der Sphingosinkinase Isoformen 1 und 2 bei allergischem Asthma am Brown-Norway-Rattenmodell - Isenberg, Nina; Justus Liebig University Giessen (My University, 2007)
Die Pathogenese allergischen Asthmas ist durch die Infiltration der Atemwege mit Leukozyten unterschiedlicher Spezies gekennzeichnet, welche durch Sekretion einer großen Zahl von Mediatorsubstanzen zu den charakteristischen klinischen und pathologisch-anatomischen Veränderungen führen. Art und Ausmaß dieser Veränderungen hängen unter anderem von Anzahl und Aktivierungszustand der eingewanderten immunkompetenten Zellen ab. Bei der allergischen Reaktion werden unterschiedliche Stadien durchlaufen, welche jeweils durch unterschiedliche Zellbilder charakterisiert sind. In den letzten Jahren wurde auch im Zusammenhang mit allergischem Asthma der Sphingolipidmetabolit Sphingosin-1-Phosphat (S1P), ein Produkt des Zellmembranstoffwechsels, bezüglich seiner Funktion bei der Pathogenese entzündlicher Erkrankungen näher untersucht. Es ist bekannt, dass S1P von vielen unterschiedlichen Zellen, darunter auch immunkompetente Zellen, synthetisiert und zum Teil sezerniert werden kann und sowohl intra- als auch extrazellulär vermittelte Effekte auf unterschiedliche Zellpopulationen ausübt. Darunter sind vor allem die mitosefördernde Wirkung sowie die Regulation der zellulären Calciumkonzentration verschiedener Zellspezies und die Förderung der Migrations- und Chemotaxisprozesse immunkompetenter Zellen bekannt. Anhand von In-vitro-Experimenten konnte bereits die Beteiligung von S1P an der Vermittlung allergischer Prozesse bestätigt werden. Des Weiteren konnten erhöhte S1P-Werte in der BAL-Flüssigkeit menschlicher Asthmatiker nachgewiesen werden. Die Herkunft von S1P bei allergischem Asthma wurde bisher jedoch nicht geklärt. Daher sollte in der vorliegenden Untersuchung am Brown-Norway-Rattenmodell anhand des Nachweises des S1P-generierenden Enzymes Sphingosinkinase auf der Proteinebene mithilfe von Immunhistochemie sowie auf der Ebene der mRNA-Expression unter Einsatz von quantitativer Reverse-Transcription-PCR (qRT-PCR) die Synthese von S1P in der Akutphase allergischen Asthmas überprüft sowie die daran beteiligten Zellspezies identifiziert und quantifiziert werden. Hierbei wurden Ratten mit allergischem Asthma mit gesunden Kontrolltieren verglichen. Nach mehrfacher Sensibilisierung mit Ovalbumin (OVA) wurden die Tiere einer inhalativen Allergenprovokation unterzogen. Zur Erfassung der unterschiedlichen Kompartimente Lungengewebe und Alveolarraum wurden sowohl gespülte als auch ungespülte Lungengewebeproben sowie mithilfe bronchoalveolärer Lavage (BAL) gewonnene Zellen untersucht. Es konnte sowohl auf der Proteinebene als auch auf der Ebene der mRNA-Expression nachgewiesen werden, dass die Allergenprovokation OVA-sensibilisierter Tiere mit einer signifikant gesteigerten Expression des Enzymes SPHK1 24 Stunden später einhergeht. An der SPHK1a-Produktion waren sowohl glatte Muskelzellen der Lungengefäße sowie der Bronchien als auch Neutrophile Granulozyten und Makrophagen beteiligt, wobei der bei den Tieren der Asthmagruppe nachgewiesene transiente Anstieg der SPHK-Expression durch Erhöhung des Anteils SPHK1a-exprimierender immunkompetenter Zellen im Lungengewebe sowie im Alveolarraum verursacht wurde. Diese konnten im Lungengewebe zu ca. 80% als ED1-positive Makrophagen und zu 20% als gp91phox-positive neutrophile Granulozyten identifiziert werden, während in der BAL bei den meisten Tieren alle SPHK1a-immunreaktiven Zellen ED1-positive Makrophagen waren. Bei vereinzelten Tieren beider Gruppen zeigten nur gp91phox-immunreaktive Zellen eine SPHK1a-Immunreaktivität. Die bei Kontrolltieren vorhandenen SPHK1a-immunreaktiven Zellen waren zum größten Teil im perivaskulären und -bronchialen Bereich akkumuliert, während bei den Asthmatieren ein großer Teil der peripher gelegenen immunkompetenten Zellen ebenfalls SPHK1a exprimierten, was möglicherweise durch den migrationsfördernen Effekt von S1P verursacht wird. Der Nachweis größerer Unterschiede zwischen Asthma- und Kontrolltieren bei der Untersuchung ungespülten Lungengewebes im Vergleich mit gespültem Lungengewebe weist auf die Migration eines Teils der S1P-produzierenden Zellen in den bronchoalveolären Raum hin. Die vorliegenden Befunde lassen auf eine Beteiligung von S1P bei der Vermittlung der charakteristischen Veränderungen in der späten Akutphase allergischen Asthmas schließen, wobei S1P vermutlich nicht nur intrazelluläre Effekte ausübt, sondern nach dessen Sekretion benachbarte fixe und mobile Zellen mit beeinflusst. 48 Stunden nach Allergenprovokation war immunhistochemisch ein Rückgang der SPHK1a-Expression durch immunkompetente Zellen in Lungengewebe und BAL festzustellen, was darauf schließen lässt, dass S1P lediglich an der Vermittlung entzündlicher Prozesse in der Akutphase allergischen Asthmas beteiligt ist. Der in der qPCR ermittelte Anstieg der SPHK1 und 2-Expression 48 Stunden nach Allergenprovokation könnte ein Hinweis auf einen zweiten Anstieg der S1P-Produktion zu einem späteren Zeitpunkt sein. Im Gegensatz zu bisherigen Untersuchungen war die relative Expression von SPHK2 in Lungengewebe und BAL stärker als die relative Expression der Isoform SPHK1, was in Ermangelung eines Antikörpers gegen diese Isoform immunhistochemisch nicht überprüft werden konnte. Die Befunde dieser Arbeit bestätigen die bisher vorliegenden Erkenntnisse zur Beteiligung der Mediatorsubstanz S1P bei allergischem Asthma. Der Nachweis der erhöhten Expression von SPHK vorwiegend durch Makrophagen, welche als wichtige Effektorzellen im Rahmen allergischen Asthmas bekannt sind, trägt zum Verständnis der in Makrophagen ablaufenden Signaltansduktionsprozesse in der Frühphase allergischem Asthmas bei. Die Aufklärung der zeitlichen Abläufe der SPHK-Expression unterstützt die Annahme, dass Makrophagen in den verschiedenen Phasen der allergischen Reaktion durch Änderung ihres Cytokinmusters unterschiedliche Funktionen ausüben können. Kenntnisse über die Rolle von S1P und die beteiligten Enzyme und Metaboliten des Sphingplipidstoffwechsels bei allergischem Asthma sind für eine mögliche pharmakologische Beeinflussung notwendig. Diese Möglichkeit wurde bereits anhand des partiellen S1P-Agonisten FTY720 untersucht und könnte in Zukunft einen Ansatzpunkt zur Therapie des allergischen Asthmas darstellen.

The pathogenesis of acute allergic asthma is characterized by the invasion of different leucocyte species into the lower airway parenchyma. The characteristic pathologic changes are caused by the secretion of a great number of different cytokines and mediator substances by the invading immune cells. The severity as well as the quality of these changes depend upon their number and their degree of activation. Each phase of the allergic reaction shows its typical pattern of invading leucocytes. For the recent years, a lot of attention has been paid to the lipid mediator sphingosine-1-phosphate (S1P), a product of cell membrane metabolism, concerning its role in the pathogenesis of inflammatory diseases, especially of allergic origin. It is well known, that S1P, which can be synthesized by various cell species, exerts different effects depending on the cell type. Some cells are able to secrete S1P into the extracellular space. The effects exerted by S1P can be mediated by intra- or extracellular pathways. Especially the mitotic effect as well as the regulation of the cellular calcium level of special cells and the enhancement of leucocyte migration and chemotactic processes have been investigated. In vitro experiments have already given evidence of the participation of S1P in the development of allergic diseases. In addition to this, increased amounts of S1P in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of asthmatic patients were found. Nevertheless, the origin of S1P in acute allergic asthma is still unknown. The aim of the present study was to find out if there is an upregulation of S1P synthesis and its cellular sources during acute allergic asthma. This was researched by investigating the expression of the S1P-generating enzymes SPHK1 and 2 on the mRNA-level using qRT-PCR and on the protein level using immunohistochemistry. Rats with allergic asthma were compared with a group of healthy control animals. All animals were sensitized by injection of ovalbumin (OVA) several times; then the animals of the asthma group were challenged with the antigen by inhalation whereas the control animals received 0,9% sodium chloride solution instead of OVA. The different compartments of the lung were differentiated by examining slices of rinsed and native lung tissue as well as samples of BALF. A significant increase of SPHK1 expression could be determined on the mRNA level as well as on the protein level 24 hours after allergen challenge. SPHK1a-generating cells were smooth muscle cells of lung vasculature and bronchi as well as macrophages and neutrophil granulocytes. The increased expression of SPHK in asthmatic animals was caused by the elevation of the number of SPHK generating immune cells in lung tissue and BALF. In lung tissue 80% of these cells were identified as ED1-positive macrophages and 20% as neutrophil granulocytes, showing immunoreactivity to the gp91phox antibody. In the most BALF samples nearly 100% of the SPHK1a-producing cells were macrophages, whereas in a few animals of both groups only neutrophil granulocytes showed a SPHK1a-expression. In the control group the greatest part of SPHK expressing cells was localized in the perivascular and peribronchial region; in asthmatic animals those cells were predominantly found in alveoles and interalveolar spaces in the peripheral regions of the lung. This might be due to the enhancing effect of S1P on cell migration. Comparison between the asthmatic and control animals revealed greater differences in the number of SPHK-expressing cells in the rinsed lung tissue than in the native tissue indicating a migration of a part of these cells into the alveolar space. These results point to a role of S1P in the generation of the characteristic inflammatory changes in acute allergic asthma; presumably not only by intracellular effects, but also by acting extracellularly on neighbour cells after being secreted. 48 hours after allergen challenge, there was a decrease of SPHK1a-positive cells both in lung tissue and BALF.This indicates that SPHK predominantly plays a role in the early phase of acute allergic asthma. The elevation of the SPHK1 and 2 expression on the mRNA level revealed by qRT-PCR might indicate a second rise of the SPHK expression in the prolonged phase of the asthmatic reaction.In contrast to previous investigations, the relative expression of the SPHK2 isoform compared to SPHK1 was higher in lung tissue and in BALF; this could not be investigated on the protein level, as there is no antibody available. The results of this work support the previous findings concerning the role of S1P in allergic asthma. The evidence of an increased SPHK-Expression predominantly caused by macrophages during the acute allergic asthmatic reaction contributes to a better understanding of the signaling pathways of the macrophage in allergic asthma. The time-dependent expression of SPHK in macrophages supports the idea, that during the different phases of the asthmatic reaction, Macrophages exert different effects according to their changes in cytokine synthesis. Knowledge of the sphingolipid metabolism in allergic asthma is necessary for a possible pharmacologic intervention. This has recently been tested by using the partial agonist of S1P, FTY720, and might be a useful tool in allergic asthma treatment in future.
Keywords: ddc:630