Charakterisierung des genetischen Defektes der GM1-Gangliosidose beim Alaskan Husky - Kreutzer, Robert; Justus Liebig University Giessen (My University, 2005)
Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des genetischen Defektes der GM1-Gangliosidose beim Alaskan Husky und die Etablierung eines molekularbiologischen Nachweisverfahrens zur frühzeitigen Detektion heterozygoter Anlageträger. Um den genetischen Defekt zu charakterisieren, wurden auf mRNS-Ebene eine PCR mit dscDNS von gesunden Kontrolltieren, heterozygoten Anlageträgern und einem homozygoten kranken Alaskan Husky durchgeführt. Dadurch wurde beim heterozygoten Anlageträger die Anwesenheit zweier mRNS-Populationen nachgewiesen: eine mit dem normalen und eine mit einem abnormalen Exon 15.Um weitere genetische Defekte bzw. deren Auswirkungen zu untersuchen, wurden mehrere kanine saueren beta-Galaktosidase-Primer in der 'nested'-PCR eingesetzt. Unter Verwendung eines Primerpaares, das den ganzen kodierenden Bereich des kaninen sauren beta-Galaktosidase-Gens amplifiziert, wurde bei gesunden Kontrolltieren eine Bande in der erwarteten Größe von 2022bp beobachtet. Bei heterozygoten Anlageträgern und beim kranken Alaskan Husky konnten 2 Banden mit einem 251bp bzw. 270bp Unterschied beobachtet werden. Mittels Sequenzierung wurde deren Zugehörigkeit zur kaninen sauren beta-Galaktosidase mRNS nachgewiesen. Zur Eingrenzung des genetischen Defektes wurden die erhaltenen PCR-Produkte als Matrize in einer 'nested'-PCR mit kaninen sauren beta-Galaktosidase spezifischen Primerpaaren, die den Bereich zwischen den Positionen 79 1881 amplifizieren, eingesetzt. Die daraus resultierenden PCR-Produkte wurden in Plasmidvektoren eingebaut und anschließend in E. coli transformiert. Durch Sequenzierung der erhaltenen Plasmide wurde festgestellt, dass alle PCR-Produkte den kodierenden Bereich des kaninen sauren beta-Galaktosidase-Gens enthalten. Es konnte ein Verlust von Exon 15 und die Anwesenheit einer 19 Basenpaaren langen Duplikation auf dem Exon 15 zwischen den Positionen 1688-1689 bei heterozygoten Anlageträgern und dem homozygot kranken Alaskan Husky detektiert werden. Da Mutationen auf dem Exon 15 des sauren ß-Galaktosidase-Gens, welche die GM1-Gangliosidose bei Hund und Mensch hervorrufen, bekannt sind, wurde eine PCR bei gesunden, heterozygoten Anlageträgern und dem homozygot kranken Hund mit einem Primerpaar durchgeführt, das einen Abschnitt des Exon 15 zwischen den Positionen 1528-1710 amplifiziert. Dadurch wurde auf DNS-Ebene die Anwesenheit eines 'Wildtyp' Exon 15 bei gesunden, eines abnormalen Exon 15 bei kranken und beider Exons bei heterozygoten Tieren nachgewiesen. Durch die gefundene 19 bp Duplikation in dem kaninen sauren beta-Galaktosidase-Gen kommt es bei heterozygoten Anlageträgern und dem homozygoten Alaskan Husky zu einer Leserasterverschiebung ('frame shift'). Hierdurch entsteht ein frühzeitiges Stoppkodon, das zur Translation eines abnormalen, 67 Aminosäuren kürzeren, Polypeptids führt, welches im Carboxy-Terminalen Bereich keine Homologie zur kaninen sauren beta-Galaktosidase aufweist. Die 19bp Duplikation enthält mehrere Cytosin-Wiederholungen. Dieses Cytosin/Adenin-Muster ( .CCCA....CCCCA .) bildet zusammen mit den 5 - und 3 - benachbarten Nukleotidsequenzen einen 'exonic splicing silencer', welcher das alternative Spleißen bevorzugt, ohne die vollständige Abschaffung des konstitutiven Spleißens. Das alternative Spleißen verursacht den Verlust von Exon 15, bis auf 5 Nukleotide (5 -GGAAG-3 ), welche die normalen Spleißstellen enthalten. Dieses Nukleotidfragment verursacht eine Leserasterverschiebung und die Entstehung eines frühzeitiges Stoppkodons, das auf dem letzten Exon des kaninen sauren beta-Galaktosidase-Gens lokalisiert ist. Nach der Translation der falsch gespleißten mRNS entsteht ein 151 Aminosäure-verkürztes Polypeptid ohne Homologie mit der kaninen sauren beta-Galaktosidase mRNS im Carboxy-Terminalen Bereich. In der vorliegenden Studie gelang zum erstenmal in der Veterinär- und Humanmedizin die Identifikation und Charakterisierung einer genetischen Modifikation als Ursache für die GM1-Gangliosidose, die direkt eine Leserasterverschiebung bewirkt, aber auch indirekt durch Beeinflussung des mRNS-Spleißens als 'exon skipping enhancer' Element agiert. Da die GM1-Gangliosidose beim Alaskan Husky klinisch, biochemisch und pathologisch (Müller et al., 1998, 2001) diagnostiziert wurde, ist die Hypothese aufzustellen, dass die Leserasterverschiebung und der frühzeitige Abbruch der Translation die Ausfallserscheinungen verursachen. Bei heterozygoten Anlageträgern hingegen wurde eine Reduzierung der sauren beta-Galaktosidase-Aktivität im Vergleich zu gesunden Tieren festgestellt, was auf die verminderte Menge an Wildtyp mRNS-Molekülen ('gene dosis' Effekt) zurückzuführen ist.

The aim of the present study was to characterize the underlying genetic defect, in GM1-Gangliosiosis of Alaskan Huskies, and to establish a molecular assay for the detection of heterozygous animals.To identify the genetic defect which causes the GM1-Gangliosidosis in the Alaskan Husky, PCR with dscDNA from healthy control dogs, heterozygous carrier, homozygous diseased Alaskan Husky and the exon 15 specific primer pair was performed. The presence of two RNA-populations containing the 'wild type' and the abnormal exon 15 (with a 19bp duplication between the positions 1688-1698) was observed in heterozygous individuals. In healthy control dog the 'wild type' Exon 15 and in homozygous diseased Alaskan Husky the abnormal exon 15 (with the 19bp duplication) was also observed. The performed PCR allowed us to investigate only the exon 15 of canine GLB1. To investigate the presence of other genetic modifications 'nested'-PCR with primer pairs covering the entire GLB1 coding region was performed. For this purpose the SMARTTMRACE method was used, which allows to obtain full-length cDNA. At first, a gene specific primer pair, to amplify the entire coding region of canine acid ß-galactosidase gene was used. Sequencing of all obtained PCR products confirmed their identity with published canine acid beta-galactosidase mRNA. The amplified coding region of canine acid beta-galactosidase was used as a template, 'nested'-PCR with gene specific primer was for amplifying cDNA regions between position 79-1881. The performed experiments permitted to postulate the existence of one mRNA population in healthy control dogs, three mRNA populations in heterozygous carrier (a normal one, the second carrying the abnormal exon 15 with the duplication and the last one without exon 15) and two mRNA populations (one carrying the abnormal exon 15 and a second one without the exon 15) in homozygous diseased Alaskan Huskies.PCR experiments using exon 15 specific primers and DNA from heterozygous carriers as well as diseased homozygous and healthy dogs were also carried out. In these experiments the presence of a 'wild type' exon 15 in healthy dogs and an abnormal exon 15 (with 19bp duplication) in a diseased homozygous Alaskan Husky was detected. In heterozygous animals both exons were observed. The 19 bp duplication can act also as 'exon skipping enhancer'. Through loss exon 15 (exon skipping) a premature termination codon is generated, because 5 nucleotides (containing the normal 5 and 3 splice site of exon 15) remain attached to the mature mRNA after removing exon 15.The mRNA molecules of both abnormal mRNA populations (with the abnormal exon 15 and with the exon skipping) are translated because of the frame shift and premature termination codons into shorter abnormal polypeptides. These polypeptides show at the carboxy-terminus (encoded by the exon 15, after the duplication, and by the exon 16) no homology to wild type canine acid beta-galactosidase. Homozygous disesased animals have only the abnormal acid beta-galactosidase gene and can not form an enzymatic active protein. In contrast, in heterozygous Alaskan Huskies the active canine acid beta-galactosidase are produced from the wild type allele. Phenotypically the dogs are healthy, but the enzymatic activity is lower compared to normal because of the presence of the abnormal allele. In the present study was achieved, for the first time in the veterinary and human medicine, the identification and characterization of a genetic modification, causing the GM1-Gangliosidosis, that directly determines a frame shift, but also indirectly act as an 'exon skipping enhancer' element influencing the mRNA-splicing.
Keywords: ddc:630