Bader, SandraSandraBader2023-03-082014-12-222023-03-082014978-3-8359-6244-6http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-112506https://jlupub.ub.uni-giessen.de/handle/jlupub/12584http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-11967Acetylcholin ist nicht nur ein Neurotransmitter, sondern wird auch in einer Reihe von nicht-neuronalen Zellen, v. a. solchen mit Barriere- oder Abwehrfunktion, gefunden. Zum Beispiel wird das Schlüsselenzym für die Acetylcholinsynthese, die Cholinacetyltransferase (ChAT), bei verschiedenen Säugern vom Kolonepithel exprimiert. Diese Zellen setzen, bei mukosaler Stimulation durch Propionat, Acetylcholin nach basolateral frei. Propionat ist eine kurzkettige Fettsäure, die physiologischerweise im Dickdarmlumen durch die bakterielle Fermentation von Strukturkohlenhydraten gebildet wird. Die Folge der Acetylcholinfreisetzung ist die Auslösung einer Anionensekretion, die in Ussingkammer-Experimenten als Anstieg des Kurzschlussstroms (Isc) erfasst werden kann. Bislang ist unklar, wie Acetylcholin vom Kolonepithel gebildet und freigesetzt wird. Deshalb war ein Ziel dieser Arbeit, die Transporter und Enzyme des non-neuronalen cholinergen Systems am distalen Kolon der Ratte zu identifizieren und funktionell zu charakterisieren. Außerdem sollte der Frage nachgegangen werden, ob parakrin wirkendes Acetylcholin seine Effekte am Epithel nur über die bereits dort beschriebenen muskarinergen Rezeptoren entfaltet oder ob auch nikotinerge Rezeptoren daran beteiligt sind. Immunohistochemische Markierungen und RT-PCR Experimente zeigten die Expression des hochaffinen Cholintransporters (CHT1), der ChAT, der Carnitinacetyltransferase (CarAT), des vesikulären Acetylcholintransporters (VAChT) und der drei Isoformen der organischen Kationentransporter (OCT 1 - 3) im Kolonepithel der Ratte. Im Unterschied zur Blockade der ChAT mittels Bromoacetylcholin hatte eine Inhibition der CarAT mit Mildronat keine hemmende Wirkung auf den durch Propionat ausgelösten Anstieg des Isc, sodass davon ausgegangen werden kann, dass die Hauptsyntheseleistung für die Acetylcholinbildung durch die ChAT getragen wird. Obwohl die Expression des VAChT auf Protein- und mRNA-Ebene im Kolonepithel nachweisbar war, spielt dieser Transporter keine Rolle für die epitheliale Acetylcholinfreisetzung wie entsprechende Versuche mit Vesamicol, einem Inhibitor des VAChT belegen, wohingegen eine OCT- Blockade die epitheliale Acetylcholinfreisetzung hemmt. An Epithelzellen (isolierte Kolonkrypten von der Ratte und HT29/B6-Zellen), die mit dem Ca2+-sensitiven Farbstoff Fura-2 aufgeladen waren, zeigte sich, dass Propionat einen Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration hervorruft, der sich durch eine Kombination von Atropin und Hexamethonium hemmen ließ, während die Vorbehandlung nur mit Atropin oder nur mit Hexamethonium nicht oder deutlich schwächer wirksam war. Dies deutet auf eine Vermittlung des Effekts von parakrin freigesetztem Acetylcholin sowohl durch muskarinerge als auch durch nikotinerge Acetylcholinrezeptoren am Epithel hin. In der Tat konnte durch zwei verschiedene nikotinische Agonisten (DMPP, Nikotin) eine Tetrodotoxin-resistente Anionsekretion an der Kolonmukosa ausgelöst werden. Die Antwort ließ sich durch den nikotinergen Rezeptorantagonisten Hexamethonium unterdrücken. RT-PCR Experimente zeigten die Expression verschiedener Untereinheiten von nikotinergen Rezeptoren, nämlich α2, α4, α5, α6, α7, α10 und β4 im Kolonepithel. In Ussingkammer-Experimenten wurde die Wirkung des potentiell nikotinerg wirkenden Cholins auf den Ionentransport untersucht. Es stellt ein Endprodukt der Hydrolyse durch die Acetylcholinesterase dar, welche histochemisch am Kolonepithel nachweisbar war. Cholin induzierte eine konzentrationsabhängige, Tetrodotoxin resistente Chloridsekretion. Diese war hemmbar durch Atropin und M3 Rezeptorblocker (und weniger gut auch durch Blockade der M1 Rezeptoren), nicht jedoch durch Hexamethonium. Ähnliche Wirkungen zeigten Butyrylcholin und Propionylcholin, zwei weitere Ester von Cholin. Aufgrund einer hohen Konzentration kurzkettiger Fettsäuren im Kolon können die genannten Ester im Kolonepithel gebildet werden, da ChAT neben Acetyl-CoA auch Butyryl-CoA und Propionyl-CoA als Substrat akzeptiert. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die cholinerge Regulation des Ionentransports am Kolon, von der man bisher annahm, dass sie lediglich durch Acetylcholin aus Neuronen des Plexus submucosus, das dann an epitheliale muskarinerge Rezeptoren bindet, getragen wird, wesentlich komplexer ist als bisher bekannt.Acetylcholine is not only a neurotransmitter, but is also found in non-neuronal cells with barrier or immune functions. For example, the enzyme choline acetyltransferase (ChAT), which catalyses acetylcholine synthesis, is expressed by the colonic epithelium of different mammals. These cells release acetylcholine across the basolateral membrane after luminal exposure to propionate, a short-chain fatty acid physiologically produced during the fermentation of carbohydrates in the colonic lumen. The functional consequence is an induction of anion secretion, measurable as increase in short-circuit current (Isc) in Ussing chamber experiments. It is unclear how acetylcholine is produced and released by colonic epithelial cells. Therefore, the aim of the present study was the identification and functional characterization of transporters and enzymes in the cholinergic system of rat colonic epithelium. Furthermore, the question should be answered whether acetylcholine exerts its epithelial effect solely via muscarinic receptors at the epithelium or whether, in addition, nicotinic receptors are involved.Immunohistochemical stainings as well as RT-PCR revealed the expression of high-affinity choline transporter (CHT1), ChAT, carnitine acetyltransferase (CarAT), vesicular acetylcholine transporter (VAChT), and organic cation transporters (OCT 1, 2, 3) in rat colonic epithelium. In contrast to blockade of ChAT with bromoacetylcholine, inhibition of CarAT with mildronate did not inhibit the propionate-induced increase in Isc, suggesting a predominant synthesis of epithelial acetylcholine by ChAT. Although being expressed, blockade of VAChT with vesamicol was ineffective, whereas inhibition of OCTs with omeprazole and corticosterone inhibited propionate-induced Isc and the release of acetylcholine into the basolateral compartment. At fura-2 loaded epithelial cells (isolated rat colonic crypts and HT29/B6 cells) propionate induced an increase in the cytosolic Ca2+ concentration, which was inhibited by a combination of atropine and hexamethonium, i.e. a combination of muscarinic and nicotinic antagonists suggesting a functional role of both receptor types in this epithelium. Indeed, two nicotinic agonists, dimethylphenylpiperazinium and nicotine, induced a tetrodotoxin-resistant anion secretion leading to an increase in Isc across colonic mucosa. The response was suppressed by the nicotinic receptor antagonist hexamethonium. RT-PCR experiments revealed the expression of different nicotinic receptor subunits, i.e. α2, α4, α5, α6, α7, α10, and β4 in colonic epithelium.Choline, the product of acetylcholine hydrolysis by acetylcholinesterase, is known for its affinity to several nicotinic receptor subtypes. Since a strong acetylcholinesterase activity has been detected by histochemical staining in colonic epithelium, the effect of choline on Isc was examined. Choline induced a concentration-dependent, tetrodotoxin-resistant chloride secretion which was, however, insensitive to hexamethonium, but was inhibited by atropine. Experiments with specific inhibitors of M1 and M3 receptors revealed that the secretion evoked by choline was mainly due to a stimulation of epithelial M3 receptors. Furthermore, also other esters of choline, i.e. butyrylcholine and propionylcholine, which can be produced by choline acetyltransferase in the presence of the respective short-chain fatty acids, stimulated epithelial muscarinic receptors. Thus the cholinergic regulation of colonic ion transport, which was up to now solely explained by cholinergic submucosal neurons stimulating epithelial muscarinic acetylcholine receptors, is much more complex than previously assumed.de-DEIn Copyrightddc:630