Transepitheliale Ionentransport-Prozesse im pulmonalen Epithel von Xenopus laevis : Modulation durch mechanischen Stress und n-Alkohole - Richter, Katrin; Justus Liebig University Giessen (My University, 2014)
Die Flüssigkeitsschicht, die dem pulmonalen Epithel aufgelagert ist, stellt ein grundlegendes Charakteristikum der Luft-Blut-Schranke aller luftatmenden Vertebraten dar. Um einen effizienten Gasaustausch und eine funktionierende Pathogenabwehr zu gewährleisten, bedarf es einer strikten Regulation der Zusammensetzung und der Höhe dieser Schicht. Die Regulation beruht dabei hauptsächlich auf transepithelialen Ionentransport-Prozessen. Fehlregulationen dieser können sich hingegen in Lungenkrankheiten wie Mukoviszidose oder pulmonale Ödeme manifestieren. Aus diesem Grund ist es wichtig die zugrundeliegenden Ionentransport-Prozesse im pulmonalen Epithel aufzuklären und Modulatoren dieser Prozesse zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden elektrophysiologische Ussing-Kammer Messungen an nativen Lungenpräparaten des Krallenfroschs Xenopus laevis (X. laevis) durchgeführt, um den Einfluss von 1) mechanischen Kräften (hydrostatischer Druck, HD; 5 cm Flüssigkeitssäule) und 2) n-Alkoholen auf die Ionentransport-Prozesse zu untersuchen.1) Aus einer früheren Studie war bekannt, dass die Applikation von HD eine ATP-Freisetzung aus den pulmonalen Epithelzellen sowie eine Aktivierung von apikal lokalisierten K+ Kanälen induziert (Bogdan et al. 2008: Pflugers Arch). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ATP-sensitive K+ (KATP) Kanäle indirekt infolge einer HD-induzierten ATP-Freisetzung via mechanosensitiver Pannexin- und Connexin-Hemikanäle aktiviert werden. Die Erkenntnisse werden dadurch begründet, dass in Anwesenheit spezifischer Pannexin- (Probenecid) und Connexin- (MFA) Hemikanal Inhibitoren die HD-induzierte ATP-Freisetzung sowie die KATP Kanal Aktivierung ausblieb. In RT-PCR Untersuchungen konnten codierende Transkripte der KATP Kanal Untereinheiten Kir6.1 und SUR1, sowie der Pannexin- (Panx1) und Connexin- (Cx30 und Cx43) Hemikanäle auf mRNA Ebene in Lungenhomogenaten von X. laevis nachgewiesen werden. Sowohl die KATP Kanal Aktivierung als auch die ATP-Freisetzung waren durch eine zyklische HD-Applikation über einen längeren Zeitraum wiederholbar und unterlagen keiner Desensitisierung. Diese Ergebnisse unterstreichen eine indirekte Aktivierung der KATP Kanäle in Folge einer mechanosensitiven ATP-Freisetzung und stellen einen neuartigen Mechanotransduktions-Prozess dar, in dem die Hemikanäle als eigentliche Mechanosensoren fungieren. 2) Die Fähigkeit von n-Alkoholen wie Ethanol (EtOH), 1-Octanol (OCT) und 1-Heptanol (HEP), die Aktivität von Ionenkanälen zu modulieren, wurde bereits in neuronalen Zellen aufgezeigt (Dilger 2002: Br J Anaesth). Zudem konnte eine OCT- und HEP-induzierte Aktivierung des CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) Cl Kanals nachgewiesen werden. Der zugrundeliegende Wirkmechanismus von n-Alkoholen ist jedoch noch nicht geklärt. Der CFTR ist im pulmonalen Epithel hoch abundant und spielt eine wichtige Rolle für die Flüssigkeitshomöostase der Lunge. Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit der Mechanismus der n-Alkohol-induzierten CFTR Aktivierung erstmals an einem nativen pulmonalen Epithel (X. laevis) in Ussing-Kammer Messungen charakterisiert werden. Des Weiteren wurde der Einfluss der n-Alkohole auf den heterolog in Oocyten exprimierten humanen CFTR (hCFTR) mittels der two-electrode voltage-clamp (TEVC) Technik untersucht. Die langkettigen n-Alkohole OCT und HEP induzierten sowohl im pulmonalen Epithel als auch in dem hier verwendeten in vitro Modell eine CFTR-abhängige Cl Sekretion. Die OCT- und HEP-induzierte CFTR Aktivierung bedingte zudem die Aktivität der Adenylatzyklase. Wurde die Adenylatzyklase durch einen spezifischen Inhibitor (MDL-12330A) geblockt, so blieben die OCT- und HEP-induzierten Effekte aus. Die Adenylatzyklase stellte demnach den Angriffspunkt der n-Alkohole dar und induzierte eine cAMP-abhängige CFTR Aktivierung. Der kurzkettige n-Alkohol EtOH zeigte in keinem der verwendeten Modellsysteme einen Einfluss auf die CFTR-Aktivität. Die Identifizierung der Adenylatzyklase als Angriffspunkt der n-Alkohole könnte einen generellen Wirkmechanismus darstellen, um die Aktivität von Ionenkanälen sowohl in nicht-erregbaren als auch in erregbaren Zellen zu modulieren.Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein neuer Mechanotransduktions-Prozess sowie Wirkmechanismus von langkettigen n-Alkoholen (OCT und HEP) identifiziert. Beide Mechanismen stellen neue Modulatoren der pulmonalen Ionentransport-Prozesse dar und beeinflussen diese maßgeblich.

The fluid layer covering the pulmonary epithelium represents a basic characteristic of the air-blood barrier of air-breathing vertebrates. In order to guarantee proper gas exchange and effective immune defence it is necessary that the composition and height of this fluid layer is tightly regulated. This regulation mainly depends on transepithelial ion transport mechanisms. This is also indicated by the fact that dysfunctions in ion transport can lead to severe lung disorders such as cystic fibrosis or pulmonary edema. Therefore, it is important to identify the basic ion transport processes of pulmonary epithelia and to identify possible modulators. In the present study, electrophysiological Ussing-chamber measurements were performed on native lung preparations of the clawed frog Xenopus laevis (X. laevis). The aim was to characterize the impact of 1) mechanical forces (hydrostatic pressure, HP; 5 cm fluid column) as well as 2) n-alcohols on ion transport processes. 1) In an earlier study it was already shown that application of HP led to an ATP-release from the pulmonary epithelial cells and induced an activation of apically localized K+ channels (Bogdan et al. 2008: Pflugers Arch). Here, it is shown that ATP-sensitive K+ (KATP) channels are indirectly activated by a HP-induced ATP-release via mechanosensitive pannexin- and connexin-hemichannels. This hypothesis is based on the findings that the HP-induced ATP-release, as well as KATP channel activation was absent after preincubation of the epithelium with specific pannexin- (Probenecide) and connexin- (MFA) hemichannel inhibitors. In RT-PCR experiments, mRNA transcripts encoding for the KATP channel subunits Kir6.1 and SUR1 as well as the pannexin- (Panx1) and connexin- (Cx30 and Cx43) hemichannels were detected in X. laevis lung homogenates. The HP-induced current decrease as well as the ATP-release were repeatable over a longer timescale and did not desensitize. The findings once more underline an indirect KATP channel activation induced by mechanosensitive ATP-release. This represents a novel mechanotransduction-process in which hemichannels function as mechanosensors. 2) The possibility of n-alcohols e.g. ethanol (EtOH), 1-octanol (OCT) and 1-heptanol (HEP) to modulate the activity of ion channels was shown earlier in neuronal cells (Dilger 2002: Br J Anaesth). Furthermore, an OCT- and HEP-induced activation of the CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) chloride channel was demonstrated. The underlying mechanism of action of n-alcohols is still unknown. CFTR is highly abundant in pulmonary epithelia and plays an important role in the fluid homeostasis of the lung. In this study the mechanism of the n-alcohol-induced CFTR activation was characterized for the first time in native pulmonary epithelia (X. laevis) by performing Ussing-chamber experiments. Furthermore, the impact of n-alcohols on heterologously expressed human CFTR (hCFTR) in X. laevis Oocytes was investigated by the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique. The long chain n-alcohols OCT and HEP induced a CFTR-dependent Cl secretion in the pulmonary epithelium as well as in the in vitro model. Interestingly, the OCT- and HEP-induced CFTR activation required the activity of the adenylate cyclase. This was supported by the fact that the effects of OCT and HEP were absent when adenylate cyclase was inhibited by the specific inhibitor MDL-12330A. Thus, the adenylate cyclase seems to be the target of n-alcohols and consequently leads to cAMP-dependent CFTR activation. Interestingly, the short chain n-alcohol EtOH showed no impact on CFTR activity in both used model systems. The identification of the adenylate cyclase as the main target for n-alcohols may be a basic mechanism of action in order to modulate ion channel activity in both, non-excitable and excitable cells.Taken together a novel mechanotransduction-process as well as a mechanism of action for long chain n-alcohols (OCT and HEP) were identified. Both mechanisms represent novel modulators that significantly influence the pulmonary ion transport processes.
Transepithelial ion transport processes in pulmonary epithelium of Xenopus laevis : modulation by mechanical stress and n-alcohols
Keywords: Mechanotransduktion; Ussing-Kammer; ATP-Freisetzung; Hemikanäle; CFTR; mechanotransduction; Ussing-chamber; ATP-release; hemichannels; CFTR; ddc:570