Murine Desmoglein 2-Mutanten als Tiermodell zur Untersuchung der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie - Hofe, Valérie; Justus Liebig University Giessen (My University, 2009)
Die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVC) ist eine erbliche Herzerkrankung, die für den plötzlichen Herztod ("sudden cardiac death") junger Sportler verantwortlich gemacht wird. Klinisch zeigen betroffene Patienten Arrhythmien und eine vergrößerte rechte Herzkammer. Ursache ist der Ersatz der Herzmuskulatur durch Bindegewebe. Der Erkrankung liegen Mutationen in Genen zu Grunde, die für Komponenten der desmosomalen Zell-Zell-Kontakte kodieren. Desmosomen sind Bestandteil der Glanzstreifen des Herzens, die an der mechanischen Kopplung der Herzmuskelzellen beteiligt sind. Den desmosomalen Cadherinen Desmoglein 2 und Desmocollin 2 kommt dabei eine Schlüsselstellung zu. Es wird angenommen, dass diese Kalzium-abhängigen Zelladhäsionsmoleküle darüber hinaus zelluläre Differenzierung beeinflussen. Da in DNA-Sequenzanalysen von ARVC-Patienten Mutationen im Desmoglein 2-Gen nachgewiesen werden konnten, sollten im vorliegenden Projekt Desmoglein 2-Mutanten in der Maus generiert werden, um ihre Auswirkungen auf Herzmuskeldifferenzierung und -funktion zu untersuchen. Dazu wurde auf Tiermodelle zurückgegriffen, bei denen die Exone 4-6 des Desmoglein 2-Gens durch Cre-Rekombinase-Erkennungsstellen flankiert sind (Allel DSG2loxP). Mit Hilfe der Cre-Rekombinase können in diesen Tieren die Exone 4-6 gezielt entfernt werden (Allel DSG2delE4-E6). Diese Exone kodieren für Abschnitte der extrazellulären Domänen 1 und 2 des Desmoglein 2-Proteins, die an der Kalzium-abhängigen Zelladhäsion beteiligt sind. Zum einen wurde ein Mausstamm etabliert, in dem sich die Genmutation ausschließlich im Herzmuskel induzieren ließ. Zum anderen wurde eine konstitutive DSG2delE4-E6-Mutante generiert, um die Auswirkungen der Mutation auf die Herzentwicklung zu beurteilen. In beiden transgenen Stämmen konnte eine erfolgreiche Rekombination des Desmoglein 2-Gens und die Synthese einer mutierten mRNA nachgewiesen werden. Analysen des Desmoglein 2-Proteins ergaben eine starke Konzentrationsabnahme in den Mutanten. Die makroskopischen Untersuchungen zeigten, dass zwar normale Herzen entstehen, sich im Laufe des Lebens aber eine deutliche Herzvergrößerung und narbige Einziehungen entwickeln. In histologischen Untersuchungen der transgenen Herzen fanden sich eine deutliche Bindegewebsvermehrung und untergehende Herzmuskelzellen. Es stellte sich heraus, dass der Untergang der Herzmuskelzellen durch Apoptose herbeigeführt wird. Immunfluoreszenzanalysen von den Desmosomenkomponenten Plakoglobin, Plakophilin 2 und Desmoplakin als auch von Komponenten anderer kardialen Zelladhäsionsstrukturen (beta-Catenin, N-Cadherin) ergaben keine deutlichen Fehl- oder Umverteilungen. Die Konzentration des Gap junction-Polypeptids Connexin 43 war jedoch deutlich in den Glanzstreifen der Mutanten verringert. Elektronenmikroskopische Analysen zeigten weiterhin einen starken Abfall der Desmomonenzahl in den Glanzstreifen, degenerierte Mitochondrien und zerstörte Sarkomere. Die in Immunoblots beobachtete starke Zunahme der Cyclin D1-Konzentration und Abnahme der p38/pp38 Konzentration deuten auf eine Beteiligung des beta-Catenin/Wnt-Signalwegs und des p38 MAPK-Signalwegs an der Entstehung der Herzveränderungen hin. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass das Fehlen der Exone 4-6 des Desmoglein 2-Gens Herzmuskelveränderungen hervorruft, die typisch für ARVC sind. Die neu generierten Tiermodelle eignen sich daher hervorragend für weitere pathophysiologische Untersuchungen.

Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) is a hereditary heart disease that is responsible for sudden cardiac death among young athletes. Clinically, these patients present arrhythmia and enlarged right ventricles. Substitution of muscle tissue by connective tissue is a pronounced histopathological finding. The disease is caused by mutations in genes that encode components of desmosomal cell-cell contacts. Desmosomes are part of the intercalated discs which contribute to the mechancial attachment of cardiomyocytes. The desmosomal cadherins desmoglein 2 and desmocollin 2 are crucial for adhesion. It is further assumed that these calcium-dependent cell adhesion molecules also affect cellular differentiation. Since DNA sequence analyses of ARVC patients identified mutations in the desmoglein 2 gene, desmoglein 2 mutant mice were generated to study the effects of this defect on differentiation and function of cardiac muscle. To this end recently established transgenic mice were used, in which exons 4-6 are flanked by cre recombinase recognition sites (allele DSG2loxP). With the help of cre recombinase exons 4-6 can be selectively deleted resulting in allele DSG2delE4-E6. These exons code for parts of the extracellular domains 1 and 2 of desmoglein 2 that are involved in calcium-dependent cell adhesion. Two mouse strains were established: (i) Conditional mutants for selective induction of desmoglein 2 mutation in cardiomyocytes and (ii) constitutive mutants to study the effect of the desmoglein 2 mutation on heart development. Successful recombination of the desmoglein 2 gene was observed in both strains. Furthermore, mutated mRNA could be detected by RT-PCR and examination of desmoglein 2 protein expression revealed considerable reduction. Macroscopically, normal hearts formed but enlargement and scars developed over time after birth. Histologically, dramatic connective tissue increase and degeneration of cardiomyocytes was noted. The latter was due to apoptosis. Immunofluorescence analyses of the desmosomal plaque components plakoglobin, plakophilin 1 and desmoplakin and also of components of other cardiac cell adhesion structures (beta-catenin, N-cadherin) did not reveal obvious mislocalization or missorting. The concentration of the gap junction component connexin 2, however, was significantly reduced in intercalated discs. Electron microscopy further showed a considerable decrease in the number of desmosomes within the intercalated discs, degenerating mitochondria and destroyed sarcomeres. The significant increase in cyclin D1 and the decrease of p38/pp38 detected in immunoblots suggest that the participation of the b-catenin/wnt and p38 signalling pathways in the development of ARVC-related cardiac deficiencies. In summary, it could be shown that loss of exons 4-6 of the desmoglein 2 gene elicits dramatic alterations of the heart muscle which phenocopy in many respects ARVC. The newly generated strains are therefore suitable models for further pathophysiological investigations.
Keywords: ddc:630