Aktivierung spezifischer T-Zellen von HIT-Patienten durch Heparin/Plättchenfaktor4-Antigenkomplexe - Tschischka, Sabine; Justus Liebig University Giessen (My University, 2009)
Der Einsatz von Heparin in der Prophylaxe und Therapie thrombembolischer Ereignisse gilt als erprobt, kostengünstig und effektiv. Die Heparin-induzierte Thrombopenie ist neben schweren Blutungskomplikationen die gefährlichste der bekannten unerwünschten Wirkungen, bei der im Gegensatz zu anderen medikamentös induzierten Thrombopenien, die zumeist über Hapten-Bildung ausgelöst werden, die Bildung spezifischer Antikörper im Vordergrund steht. Die daraus folgenden therapeutisch denkbaren Möglichkeiten mit Immunsuppressiva machen die HIT Typ II zu einem interessanten Gegenstand der Forschung. Obwohl eine allgemein akzeptierte Theorie zur Pathogenese existiert, ist die genauere Beteiligung des zellulären Immunsystems weitgehend unbekannt.In der vorgelegten Arbeit wurde den Fragen nachgegangen, inwieweit sich die immunologische Reaktion bei Reexposition in vitro nachvollziehen lässt, welche Zellen des Immunsystems vorrangig beteiligt sind und ob eine Zell-Interaktion insbesondere der Lymphozyten nachweisbar ist und zur Bildung der spezifischen Antikörper führt.Zunächst konnte in den durchgeführten Experimenten gezeigt werden, dass sich PBMC von HIT-Patienten in vitro durch den Heparin/PF4-Komplex zur Proliferation stimulieren lassen, während dies mit Zellen gesunder Spender nicht gelang, so dass die wesentliche pathogenetische Reaktion sich tatsächlich in vitro nachstellen lässt. Um die Beteiligung von Zellen des Immunsystems näher zu charakterisieren, wurden periphere mononukleäre Zellen (PBMC) von zehn Patienten mit klassischer HIT Typ II und von 5 gesunden Spendern isoliert und mit Heparin/PF4-Komplex, PF4, Heparin und nur mit Medium 4 Tage lang sowohl in An- als auch Abwesenheit von autologen Thrombozyten kultiviert. Hierbei konnten wir eine leichte Proliferation von CD4-positiven T-Zellen an Tag 4 des Stimulationsversuchs mit autologen Thrombozyten und Heparin/PF4-Komplex feststellen, während keine Proliferation von CD8-positiven T-Zellen gezeigt werden konnte. Wir beobachteten eine deutliche Aktivierung der CD4-positiven T-Zellen mit einer Hochregulation der Aktivierungsmarker CD25 sowie CD154. Hierzu passend konnte eine Zunahme von CD40 auf Zellen, die wir für antigenpräsentierende Zellen halten, gemessen werden. CD154 wirkt als ein Mediator bei T-Zell-abhängiger B-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung. Im Gegensatz zu diesem Versuchsansatz konnten wir keine dieser Reaktionen bei der Verwendung von PBMC gesunder Spender beobachten. Aufgrund unserer Ergebnisse aus dem Stimulationsversuch und weil es sich bei CD154 um einen potenten Modulator physiologischer Prozesse, wie zum Beispiel T-Zell-vermittelter Effektorfunktionen handelt, postulierten wir eine Beteiligung aktivierter T-Helferzellen an der HIT-Pathogenese. Um diese Hypothese zu beweisen, erweiterten wir den Stimulationsversuch, indem wir CD154 mit einem monklonalen Antikörper vor der Kultur auf den peripheren mononukleären Zellen blockten. Wir beobachteten hierbei eine weit geringere Proliferation CD40-positiver Zellen, sowie eine fehlende T-Zell-Aktivierung. Das Ergebnis des Blockversuchs bestätigt somit die entscheidende Rolle der CD40-CD154-Interaktion für die in vitro Aktivierung und Reaktivierung spezifischer T-Helferzellen von HIT-Patienten.Mittels eines spezifischen ELISA ließ sich trotz der deutlichen Aktivierung keine Antikörperproduktion nachweisen, da es möglicherweise durch die CD40-CD154-Interaktion zwar zur Aktivierung der spezifischen Lymphozyten, jedoch nicht zur Ausreifung zu Antikörper produzierenden Plasmazellen kam.Unsere Ergebnisse bestätigen die bisherige Auffassung der HIT-Pathogenese als spezifische immunologische Reaktion und zeigen mit der Proliferation aktivierter T-Lymphozyten und der CD40-CD154-Interaktion weitere interessante Details der autoimmunologisch vermittelten Pathogenese auf.

The use of Heparin in prophylaxis and therapy of thrombembolic events is regarded as proved, economical and effective. Heparin-induced thrombocytopenia is the most dangerous of the known adverse events besides severe bleeding complications. In contrast to other drug-induced thrombocytopenias which are caused by hapten-formation, HIT is characterized by production of specific antibodies. Because of the conceivable therapeutic options with immunesuppressiva HIT Type II becomes an interesting object of research. Although there exists an accepted theory of the pathogenesis, the more particular contribution of the cellular immune system is still unknown. In our investigations we considered how far the immunological reaction can be established in vitro, which immune cells are mainly involved and if an interaction between lymphocytes can be observed and leads to production of specific antibodies.To characterize T-cell involvement peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from ten patients with classical HIT and five healthy donors were obtained and cultivated with heparin/PF4 complexes, PF4 alone, heparin alone and medium alone in the presence or absence of autologous thrombocytes. Thereby we could detect a slightly proliferation of CD4+ T-cells on day 4 of co-culture with autologous thrombocytes and the heparin/PF4 complexes whereas no proliferation of CD8+ T-cells could be noted. Impressively we could observe a bright activation of these CD4+ T-cells defined by an upregulation of the activation molecule CD25 as well as CD154. Suitable we could detect an upregulation of CD40 on non-T-cells, which we postulate to be antigen-presenting cells. CD154 (CD40L) is functioning as a mediator of T cell-dependent B cell activation, proliferation and differentiation. In contrast to this culture, we couldn t observe any of these reactions by using PBMC of healthy donors. Because CD154 modulates physiologic processes, such as T cell mediated effector functions, we postulated an involvement of activated T-helper-cells in the pathogenesis of HIT. With a view to proof this hypothesis we extended our first assay by blocking CD154 with a monoclonal antibody on PBMC before culture. As a result we observed less proliferation of CD40-positive cells as well as a lacking of T-cell activation. The results of this blocking assay confirm the decisive role of CD40-CD154-interaction in activation and reactivation of specific T-helper-cells of HIT-patients.Despite the clear cell activation there could not be found a production of antibodies in a specific ELISA. CD40-CD154-interaction might have lead to activation of specific lymphocytes, but not to maturation of antibody producing plasma cells. Our results confirm the actual opinion of HIT-pathogenesis as a specific immunological reaction and show further interesting details of the autoimmunological pathogenesis with the proliferation of activated T-cells and the interaction of CD40 and its ligand CD154.
Activation of specific T-cells from patients with HIT Type II with heparin/platelet factor 4 antigen comlexes
Keywords: Heparin-induzierte Thrombopenie; CD40-Ligand; Thrombose; Antikoagulation; Heparin-induced thrombocytopenia; CD40-ligand; thrombosis; anticoagulants; ddc:610