Fusionsproteine aus beta2-adrenergem Rezeptor und GFP als pH-sensible Sensoren - Hartmann, Eva; Justus Liebig University Giessen (My University, 2006)
Eukaryoten können über Rezeptormoleküle der Plasmamembran externe Reize in intrazelluläre Signale umwandeln. Bei G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) wird die Signalübermittlung durch Vorgänge wie Desensibilisierung, Internalisierung und Resensibilisierung gesteuert. So auch beim beta2-adrenergen Rezeptor (beta2AR), welcher der am besten untersuchte GPCR ist. Er gelangt im Vorgang der Internalisierung auf seinem intrazellulären Weg in zytosolische Kompartimente, wie Endosomen und Lysosomen. Der in diesen Organellen vorliegende saure pH soll einerseits durch Konformationsänderungen die Dephosphorylierung und Resensibilisierung der Rezeptoren ermöglichen und dient andererseits in Lysosomen als Voraussetzung für die Aktivität der lysosomalen Hydrolase, welche Rezeptorstrukturen abbaut. Durch diese komplexen Vorgänge wird die Anzahl der Rezeptormoleküle an der Zelloberfläche reguliert und verhindert, dass durch länger andauernde Rezeptorstimulierung eine Daueraktivierung der intrazellulären Signalkaskaden erfolgt. Mit der Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde ein relativ indifferenter, genetisch kodierter zellulärer Fluoreszenzmarker zur Klärung von zellbiologischen Fragestellungen gefunden. Durch Strukturanalysen wurden Mutationsstellen identifiziert, welche die Konstruktion unterschiedlich pH-sensitiver und unterschiedlich farbiger GFP-Mutanten ermöglichten. Durch Konstruktion von Fusionsproteinen aus dem beta2AR und GFP sollten in dieser Arbeit pH-Sensoren erstellt werden, die pH-Veränderungen in der Umgebung des ß2AR während des Vorgangs der Internalisierung nachweisen. Dazu wurde ein pH-sensitives GFP an den N-Terminus des Rezeptors und ein pH-insensitives Fluorophor an den C-Terminus des beta2AR kloniert. Dadurch, dass der C-Terminus des Rezeptors beim Vorgang der Internalisierung im Zytosol verbleibt und der N-Terminus in die unterschiedlichen intrazellulären, kompartimentären Milieus eindringt, sollte durch Messung der Fluoreszenzverhältnisse von pH-sensitivem zu pH-insensitivem Fluorophor eine Aussage über den pH-Wert in der Umgebung des extrazytoplasmatischen Fluorophors möglich sein. Durch genaue Charakterisierung der Rezeptormutanten konnte gezeigt werden, dass die beta2AR-Funktion in den Fusionsproteinen unbeeinflusst blieb und diese auf physiologische Weise internalisierten. Die Rezeptormutanten zeigten außerdem die gewünschten pH-sensitiven Eigenschaften und konnten nachweisen, dass der beta2AR im Vorgang der Internalisierung eine Veränderung seines Umgebungs-pH erfährt.

Eucaryotical organisms are able to transfer external signals into internal signals by receptors belonging to the plasmamembrane. G-protein coupled receptors (GPCR) can regulate the signaltransduction by mechanisms like desensitization, internalization and resenzitation. This is also the case with the beta2AR who is a well characterized GPCR. GPCRs pass cytosolic compartiments like endosomes and lysosomes in the cell during internalization. The acid pH in these organells is said to be important for conformational changes and allows the resenzitation of the internalized receptor by dephosphorylation. The acid pH is also needed for the activity of the lysosomal hydrolase, which destroys degradaded receptor structures. With these complex mechanisms the number of receptor molecules in the cell surface is regulated and the overstimulation of the cell is prevented. With the recovery of the green fluorescent protein as a useful fluorescent marker for experiments to answer cellbiological questions there was a great intrest in the structure of this protein. By structural analysis a lot of mutation points were found, which allowed the construction of different pH-sensitive and different coloured GFP-Mutants. By making a construct consisting of GFP and beta2AR a pH-sensor should be constructed which is able to show pH-changes in the surrounding of the beta2AR during internalization. For this reason a pH-sensitive GFP was fused to the N-terminus of the receptor and a pH-insensitive fluorophore was cloned to the C-terminus of the beta2AR. The idea was made of the knowledge that the C-terminus of the receptors remains staying in cytosol during internalization and that the N-terminus gets into the different intracellular compartiments and is delivered to the changing pH-milieus. By measuring the fluorescence differences between the C-terminal and N-terminal GFP-mutants we wanted to show the changes of pH in the surrounding of the extracytoplasmatic fluorophor. The characterization of the receptor mutant showed that the beta2AR function in the protein remained untouched. The receptor internalized physologically. The receptor mutants did also show the expected pH-sensitive qualities and showed that the beta2AR passes different pH-mediums during internalization.
Keywords: ddc:630