Einfluß von endogenem NO auf die Phosphorylierung der p38 MAP-Kinase in isolierten Kardiomyozyten der adulten Ratte und Maus - Wingerning, Sandra; Justus Liebig University Giessen (My University, 2008)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte in vitro gezeigt werden, daß mikrovaskuläre Endothelzellen der Ratte einen deutlich höheren eNOS-Gehalt als adulte Kardiomyozyten der Ratte aufweisen und dadurch eine erhöhte p38 MAPK-Phosphorylierung durch endogenes NO zeigen. Diese wird bei den Endothelzellen durch Hemmung der eNOS durch L-NA stark reduziert, während bei den Kardiomyozyten unter gleichen Versuchsbedingungen eine deutliche Steigerung zu sehen ist, welche nach 30 Minuten ein Maximum erreicht und danach wieder langsam abfällt. Des Weiteren wurde der Einfluß unterschiedlicher Radikale (ROS, NO) untersucht. Hierbei wurde ersichtlich, daß die unter Angiotensin II induzierten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) eine Steigerung der Phosphorylierung bewirken. Ergebnisse von Untersuchungen mit exogenem NO in Form von SNAP und Spermin-NONO übersteigen dieses Niveau und führen zu einer massiven Erhöhung der Phosphorylierung. Versuche zur Rolle der durch NO aktivierten Guanylatzyklase postulieren eine Hemmfunktion hinsichtlich der p38 MAPK-Phosphorylierung über einen cGMP-Signalweg. Es konnte sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene eine gesteigerte Expression der Zytokine TGFbeta und TNFalpha in Abwesenheit von NO dargelegt werden. Im in vivo-Modell anhand der transgenen eNOS-defizienten Mäuse und deren Wildtypen wurde unter anderem die Spezifität der eingesetzten Antikörper nachgewiesen. Nach Induktion mit L-NA verhielten sich die Kardiomyozyten der Wildtypmäuse vergleichbar mit denen der Ratten. Nach Inhibierung der eNOS erfolgte eine deutliche Zunahme der p38-Phosphorylierung, welche ab 30 Minuten nach Induktion eine deutliche und stetige Steigerung erfuhr, die ihr Maximum noch nicht bis 60 Minuten erreichte. Diese Steigerung der p38-Phosphorylierung blieb bei den eNOS-defizienten Mäusen aus. Die Meßwerte übertrafen über eine Stunde nicht das Kontrollniveau. Vergleichend zu den Ergebnissen der Kardiomyozyten der Ratte unter L-NA Inkubation ist in den Zellen der eNOS-defizienten Mäusen (eNOS-/-) die Zytokin-Exprimierung deutlich gegenüber ihren Wildtypen (eNOS+/+) erhöht. Es verdeutlicht sich, daß basale konstitutive NO-Konzentrationen die p38-Phosphorylierung und somit die Zytokin-Exprimierung hemmen. Ebenso führt eine Aktivierung des cGMP-Signalweges zu einer reduzierten p38-Phosphorylierung. In Abwesenheit von endogenem NO und durch exzessive exogene NO-Gabe wird die p38-Phosphorylierung und Zytokin-Exprimierung deutlich gesteigert.

In the present study it could be shown in vitro that microvascular endothelial cells of the rat contain a significantly higher content of eNOS than adult cardiomyocytes of rats, thus showing an increased p38 MAPK-phosphorylation by endogenous NO. By inhibiting the eNOS by means of L-NA the phosphorylation in endothelial cells is highly reduced, whereas cardiomyocytes show a significant increase under the same test conditions. This increase reaches its maximum after 30 minutes, after this period you can watch a slow decrease. Furthermore, the influence of different radicals (ROS, NO) was examined. It became evident that the reactive oxygen species (ROS), which were induced by angiotensin II, cause an increase of phosphorylation. The application of exogenous NO in form of SNAP and Spermin-NONO causes an excess of this level and leads to a massive increase of phosphorylation. Tests concerning the role of guanylate cyclase activated by NO postulate an inhibition with respect to p38 MAPK-phosphorylation via a cGMP-signal path. Both on the level of genes and proteins there could be demonstrated an increased cytokine expression of TGFbeta and TNFalpha in absence of NO. The fact that the antibodies used are specific was proved in in vivo-models by means of transgenic eNOS-deficient mice and their wild types. After induction with L-NA the cardiomyocytes of the wild-type mice behaved comparable to those of the rats. After inhibition of eNOS a significant increase of the p38-phosphorylation showed. This increase was significantly and constantly raised from 30 minutes after induction, not reaching its maximum up to 60 minutes. The eNOS-deficient mice did not show this increase of p38-phosphorylation. This measurement did not surpass the control level for over an hour. As compared to the results of rats cardiomyocytes under L-NA incubation the cytokine expression is significantly increased in the cells of eNOS-deficient mice (eNOS-/-) as compared to their wild types (eNOS+/+). It has become evident that basal constitutive concentrations of NO inhibit the p38-phosphorylation and consequently the cytokine expression. In addition, the activation of the cGMP-signal path leads to a reduced p38-phosphorylation. In the absence of endogenous NO and after an excessive exogenous donation of NO the p38-phosphorylation and cytokine expression is significantly increased.
Keywords: ddc:630