Regulation des porenbildenden Toxins Listeriolysin O durch die enzymatische Aktivität der Phosphatidylcholin-spezifischen Phospholipase C von Listeria monocytogenes - La Pietra, Luigi; Justus Liebig University Giessen (My University, 2020)
Bakterielle porenbildende Toxine bilden eine außerordentlich heterogene Gruppe an Exotoxinen, welche ein gemeinsames Ziel verfolgen: Die Überwindung von biologischen Membranen. Dies kann zum einen durch direkte Zerstörung von Membranen durch Bindung und Oligomerisierung der Toxine oder zum anderen durch die Aktivierung von intrazellulären Signalkaskaden und daraus resultierender Internalisierung von pathogenen Bakterien in Zellen erfolgen. Bei einem dieser Toxine handelt es sich um das Cholesterin-abhängige Cytolysin Listeriolysin O, welches vom intrazellulärem pathogenem Bakterium Listeria monocytogenes produziert und sekretiert wird. Als zentraler Virulenzfaktor ermöglicht Listeriolysin O die Freisetzung des Bakteriums aus intrazellulären Vakuolen in das Cytosol der Wirtszelle, der replikativen Nische des Bakteriums.Bemerkenswerterweise führt die membranlytische Aktivität von Listeriolysin O zu keiner offenkundigen Zerstörung der infizierten Wirtszelle. Ein Grund hierfür ist die strikte Kontrolle der cytolytischen Aktivität von Listeriolysin O durch wirtseigene Regulationsmechanismen, wie beispielsweise Veränderungen des pH-Wertes und des Redox-Status oder durch proteolytische Kontrolle. Im Vergleich hierzu sind kaum regulatorische Mechanismen der Kontrolle des Toxins aus bakterieller Sicht bekannt.Durch die Verwendung einer Kombination aus isogenen Listeria monocytogenes Mutanten und biochemischen Untersuchungen mit gereinigten Phospholipasen des Bakteriums konnten in dieser Arbeit neue bakterielle und zelluläre regulatorische Mechanismen der Kontrolle von Listeriolysin O aufgedeckt werden.So konnte gezeigt werden, dass Phosphocholin, ein Reaktionsprodukt der Phosphatidylcholin-spezifischen Phospholipase C von Listeria monocytogenes, ein potenter Inhibitor von intra- und extrazellulären Listeriolysin O-Aktivitäten ist. Die Bindung von Phosphocholin ist unabhängig vom Redox-Status des Toxins und führt zu einer Inhibition des Listeriolysin O-induzierten Calcium-Einwärtsstroms, zu mitochondrialem Schaden und Apoptose. Außerdem konnte eine Inhibition der hämolytischen Aktivität des Toxins beobachtet werden, welche nicht nur auf Listeriolysin O beschränkt war, sondern auch bei weiteren Vertretern von Cholesterin-abhängigen Cytolysinen beobachtet wurde (Pneumolysin und Streptolysin O). Als möglicher Grund für die inhibitorische Wirkung konnte eine direkte Interaktion von Phosphocholin und Listeriolysin O ermittelt werden, welche zu einer erhöhten Dissoziation der Listeriolysin O-Pore von Membranen führte. Die Verwendung des Phosphocholin-haltigen Phospholipids Phosphatidylcholin führte hingegen zu einer Steigerung der hämolytischen Aktivität des Toxins. In diesem Zusammenhang wurde außerdem die Wirkungseise des Glykosaminglykans Heparin auf die hämolytische Aktivität von Listeriolysin O untersucht. Erstaunlicherweise führte die Zugabe von Heparin ebenfalls zu einer Steigerung der hämolytischen Aktivität des Toxins.Zuletzt konnte für Phosphocholin eine zusätzliche Funktion in der Adhäsion und Invasion von Listeria monocytogenes während der Infektion identifiziert werden. Die exogene Zugabe von Phosphocholin führte zu einer stark erhöhten Invasion des Bakteriums in Epithelzellen in einer viruelnzfaktorunabhängigen Art und Weise. Hierbei könnte es sich um einen neuen, bisher unbekannten Mechanismus der Adhäsion von Listeria monocytogenes an Wirtszellen handeln.Die vorgestellten Daten dieser Arbeit zeigen somit neue Strategien von Listeria monocytogenes auf, um die cytotoxische Aktivität von Listeriolysin O zu modulieren und an Epithelzellen zu adhärieren. Diese Mechanismen beruhen dabei sowohl auf die enzymatische Aktivität der Phosphatidylcholin-spezifischen Phospholipase C als auch auf die Bindung von Heparin an Listeriolysin O.Da eine Vielzahl an Bakterien sowohl ein porenbildendes Toxin als auch eine Phospholipase C exprimieren und Heparin in Form des nah verwandten Heparansulfat ubiquitär in Wirtszellen vorkommt, könnte es sich bei diesen Mechanismen um allgemeingültige bakterielle Prinzipien der Regulation handeln.

Bacterial pore forming toxins form an extraordinarily heterogeneous group of exotoxins that share a common goal: To cross biological membranes. This can be achieved either by direct disruption of membranes through binding and oligomerization of the toxins or by activation of intracellular signaling cascades, resulting in internalization of pathogenic bacteria in cells. One of these toxins is the cholesterol-dependent cytolysin listeriolysin O, which is produced and secreted by the intracellular pathogenic bacterium Listeria monocytogenes. As a central virulence factor, listeriolysin O enables the bacterium to be released from intracellular vacuoles into the cytosol of the host cell, the replicative niche of the bacterium.Remarkably, the membranolytic activity of listeriolysin O does not lead to an overt destruction of the infected host cell. One reason for this is the strict control of the cytolytic activity of listeriolysin O by host regulatory mechanisms, such as changes in pH and redox status or by proteolytic control. In comparison to that, hardly any regulatory mechanisms of controlling the toxin by the bacterium itself are known.Using a combination of isogenic Listeria monocytogenes mutants and biochemical studies with purified phospholipases of the bacterium, this work uncovers new bacterial and cellular regulatory mechanisms of listeriolysin O-control.It was shown that phosphocholine, a reaction product of the phosphatidylcholine-specific phospholipase C of Listeria monocytogenes, is a potent inhibitor of intra- and extracellular listeriolysin O activities. The binding of phosphocholine is independent of the redox status of the toxin and leads to inhibition of listeriolysin O-induced calcium influx, mitochondrial damage and apoptosis. In addition, an inhibition of the toxin´s hemolytic activity was observed, which was not only limited to listeriolysin O, but was also observed in other representatives of cholesterol-dependent cytolysins (pneumolysin and streptolysin O). As a possible reason for the inhibitory effect, a direct interaction of phosphocholine and listeriolysin O was identified, which led to an increased dissociation of the listeriolysin O-pore from membranes. In contrast, the use of the phosphocholine-containing phospholipid phosphatidylcholine led to an increase in the hemolytic activity of the toxin. In this context, the effect of the glycosaminoglycan heparin on the hemolytic activity of listeriolysin O was also investigated. Surprisingly, the addition of heparin also led to an increase in the hemolytic activity of the toxin.Finally, an additional function of phosphocholine in the adhesion and invasion of Listeria monocytogenes during infection was identified. The exogenous addition of phosphocholine led to a greatly increased invasion of the bacterium into epithelial cells in a virulence factor independent manner pointing towards a new, previously unknown mechanism of adhesion of Listeria monocytogenes to host cells.The data presented in this work thus reveal new strategies of Listeria monocytogenes to modulate the cytotoxic activity of listeriolysin O and to adhere to epithelial cells. These mechanisms are based both on the enzymatic activity of the phosphatidylcholine-specific phospholipase C and on the binding of heparin to listeriolysin O.Since a large number of bacteria express both a pore forming toxin as well as a phospholipase C and heparin is ubiquitously present in host cells in form of the closely related heparan sulfate, these mechanisms could be general bacterial principles of regulation.
Keywords: ddc:610