Expression von Holophytochrom in Escherichia coli - Landgraf, Frank Thomas; Justus Liebig University Giessen (My University, 2003)
Ziel der Arbeit war es, die < i> in-vivo< /i> Holophytochromsynthese in < i> E.coli< /i> zu etablieren, um ausreichend < i> in-vivo< /i> assembliertes Holophytochrom herstellen zu können. Ferner kann die Methode für Untersuchungen im Rahmen eines < i> random-mutagenesis screening< /i> Verfahrens nutzbar gemacht werden. Die Etablierung dieser Methode ist für einen entsprechenden Ansatz in < i> S.cerevisiae< /i> von Vorteil, da dadurch die Möglichkeit entsteht, nach Phytochrom Interaktionspartnern mittels der Hefe-2-Hybrid Methode unter Berücksichtigung des Pr/Pfr-Zustandes von Phytochrom zu suchen. Um Holophytochrom zu bilden, wurden die entsprechenden Gene aus < i> Synechocystis< /i> PCC 6803 (< i> cph1, ho und pcyA< /i> ) zur Expression gebracht. Daraufhin konnte erstmals lösliches Holo-Cph1 gebildet werden. Bei näheren Analysen fiel eine hypsochrome (Blau-) Verschiebung von ~5-nm auf, die nur bei einer < i> in-vivo< /i> , jedoch nicht bei einer < i> in-vitro< /i> -Assemblierung auftrat. Durch SDS-PAGE Analysen wurde die Präsenz eines Fusionsproteins aus HO und PcyA festgestellt, welches aufgrund der < i> sup< /i> -Eigenschaft von < i> E.coli< /i> (XL1-blue) zustandegekommen war. Durch die Wahl eines entsprechenden < i> sup< sup> -< /sup> E.coli< /i> -Stammes konnte die Bildung eines Fusionsproteins verhindert werden. Das Fusionsprotein ergab zwar ein farbliches Pigment, jedoch konnte dieses Pigment kaum mit dem dargebotenen Apo-Cph1 assemblieren. Durch die < i> in-vivo< /i> -Assemblierung von Apo-Cph1 mit Phycocyanobilin konnte jedoch nicht die schon für das Apoprotein und für < i> in-vitro< /i> assembliertes Holo-Cph1 beobachteten Aggregationstendenzen nach Aufschluss der Bakterien verhindert werden. Um diese Aggregationen zu unterbinden, wurde die Co-Expression von molekularen Chaperonen (sHSP und GroE-L/S) untersucht. Die Expression der oben erwähnten molekularen Chaperonen konnte die Löslichkeit von Holo-Cph1 < i> in vivo< /i> nicht verbessern und die Aggregationsbildung < i> in-vitro< /i> nicht unterbinden. Durch Deletion des C-Terminus (Histidin-Kinase-Domäne) von Cph1 entsteht ein Konstrukt (Cph1delta2), das < i> in-vitro< /i> nicht mehr aggregiert. Cph1delta2 ergab nach Co-Expression mit HO und PcyA ebenfalls vollständig < i> in-vivo< /i> assembliertes Holophytochrom und konnte nach einer optimierten Ni-NTA-Affinitätschromatographie zu einem hohen Grad aufgereinigt werden, was sich an dem im UV-Vis gemessenen Absorptionsverhältnis von 1.16 wiederspiegelt.
Keywords: Phytochrom; Escherichia coli; Cph1; PcyA; ddc:570