Wiedereinsetzen der Steroidbiosynthese nach Downregulation der Hodenfunktion beim Rüden : Expression von StAR-Protein, P450scc und P450c17 - Gentil, Michaela; Justus Liebig University Giessen (My University, 2012)
Die beiden Funktionen des Hodens Steroidbiosynthese und Spermatogenese sind hinreichend beschrieben, die Mechanismen ihrer Regulation hingegen sind komplex und noch nicht vollständig erforscht. Mittels slow-release GnRH-Implantat kann beim Rüden eine Downregulation der endokrinen und germinativen Hodenfunktion herbeigeführt werden, die nach Entfernung bzw. Wirkverlust des Implantats vollständig reversibel ist. Durch eine gezielte Verfolgung des Ingangkommens der Hodenfunktion nach Downregulation können daher neue Erkenntnisse zur Steuerung der Hodenfunktion gewonnen werden.Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Wiedereinsetzen der Steroidbiosynthese im Verlauf der Rekrudeszenz der Spermatogenese nach Downregulation der Hodenfunktion näher zu charakterisieren. Dazu wurde bei 30 adulten Beagle-Rüden das GnRH-Implantat Gonazon® (18,5mg Azagly-nafarelin) 5 Monate nach Applikation (im Zustand der Downregulation) entfernt, wodurch das Ingangkommen der Hodenfunktion eingeleitet wurde. Ab diesem Zeitpunkt wurden jeweils 3 4 Hunde im Abstand von 3 Wochen chirurgisch kastriert und die Hoden für weiterführende Untersuchungen fixiert. Aufgrund der individuell unterschiedlich schnellen Rekrudeszenz der Spermatogenese erfolgte die Zuordnung zu 4 Entwicklungsgruppen ( developmental group , DG) anhand des histologisch am weitesten entwickelten Keimzellstadiums: DG A Spermatozyten, DG B runde Spermatiden, DG C elongierende Spermatiden, DG D elongierte Spermatiden. Statt Gonazon® kam bei 3 adulten Beagle-Rüden das GnRH-Implantat Profact® Depot (6,6 mg Buserelinacetat) zur Anwendung. Diese Rüden wurden 5 Monate nach Implantatapplikation chirurgisch kastriert. Von den o. a. Tieren wurden u. a. zum Zeitpunkt der Kastration Blutproben für die Bestimmung von Testosteron, LH und FSH entnommen. Als Kontrollgruppe (CG) dienten 5 unbehandelte, adulte Beagle-Rüden. Ergänzend dazu konnten die Hoden von 3 zur Kastration vorgestellten, 2 Monate alten, juvenilen Mischlingsrüden gewonnen werden.Zur Charakterisierung des Wiederanlaufens der Steroidbiosynthese wurden 3 wesentliche Faktoren der testikulären Steroidbiosynthese Steroidogenic Acute Regulatory- Protein (StAR-Protein), Cytochrom P450 side chain cleavage (P450scc) und Cytochrom P450 17alpha-Hydroxylase/17,20-Lyase (P450c17) gewählt, deren Expression auf mRNA-Ebene mittels qualitativer und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion sowie auf Proteinebene mittels Immunhistochemie untersucht wurde. Daneben erfolgte eine morphologische Charakterisierung der Leydigzellen und die Bestimmung des Flächenanteils des Interstitiums auf histologischer Ebene.Mittels Western Blot wurde die Spezifität der in der Immunhistochemie verwendeten Primärantikörper im Vorfeld bestätigt, wobei aufgrund der im Vergleich zu Kontrollgewebe anderer Tierarten beobachteten Unterschiede in der molekularen Masse von einer hundespezifischen Expression von P450scc und P450c17 auszugehen ist. Die zelluläre Lokalisation der untersuchten Proteine war auf die Leydigzellen im Interstitium begrenzt, deren Zellkerngröße unter Downregulation signifikant reduziert war.Wie anhand der unter bzw. nahe der Nachweisgrenze liegenden Testosteronwerte sowie der im Vergleich zu CG signifikant reduzierten Expression von StAR-Protein, P450scc und P450c17 gezeigt werden konnte, wirkte sich die Downregulation der Hodenfunktion mittels GnRH-Implantat auf das gesamte System der Steroidbiosynthese aus. Die Verfügbarkeit aller 3 untersuchten Parameter war sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene erheblich limitiert.Nach Aufhebung der Downregulation durch Implantatentfernung fand die Aufregulation der Steroidbiosynthese unmittelbar und in einem engen Zeitfenster zwischen DG A und DG B statt, wobei Hinweise auf einen Rebound-Effekt vorliegen. Eine vollständige Steroidbiosynthese war bereits wenige Wochen nach Aufhebung der Downregulation wiederhergestellt, während die Rekrudeszenz der Spermatogenese zu diesem Zeitpunkt lediglich die Stufe der runden Spermatiden erreicht hatte. Eine vollständige Spermatogenese konnte hingegen frühestens 9 Wochen nach Implantatentfernung nachgewiesen werden.Zwischen den beiden Implantaten Gonazon® und Profact® Depot konnte zum Zeitpunkt der Downregulation kein signifikanter Unterschied festgestellt werden, der Tendenz nach war die Downregulation nach Implantation von Profact® Depot jedoch stärker ausgeprägt. In den juvenilen Hoden waren große Mengen StAR-Protein-, P450scc- und P450c17-mRNA vorhanden, auf Proteinebene dagegen war nur eine sehr geringe Expression dieser 3 Parameter nachweisbar. Die Expression der genannten Proteine im juvenilen Hoden scheint daher posttranskriptional reguliert zu werden.

Testicular functions in regard to steroid biosynthesis and spermatogenesis are well described, but the underlying regulations are complex and not yet completely understood. Application of slow-release GnRH-implants in dogs results in downregulation of testicular endocrine and germinative function, which is fully reversible after implant removal or loss of efficacy. Therefore monitoring of the onset of testicular function after downregulation could lead to new insights into regulation of testicular functions.Aim of the present study was to characterize the restart of steroid biosynthesis in the course of recrudescence of spermatogenesis after abolition of downregulation. In 30 adult male Beagle dogs reestablishment of testicular function was initiated by removal of the GnRH-implant Gonazon® (18.5mg azagly-nafarelin) 5 months after implantation. Testes were removed from 3 4 dogs in 3-week intervals and were preserved for further investigations. Due to the individually different speed of recrudescence of spermatogenesis, dogs were assigned to 4 groups according to the most developed germ cells observed: Developmental group (DG) A spermatocytes, DG B round spermatids, DG C elongating spermatids, DG D elongated spermatids. Three adult male Beagle dogs received the GnRH-implant Profact® Depot (6.6 mg buserelinacetat) instead of Gonazon® and testes were removed 5 months after implant application. Blood samples for assay of testosterone, LH and FSH were taken at castration. Five adult male Beagle dogs served as untreated controls (CG). Additionally testes of 3 premature, 2 month old crossbreed dogs (JG) could be obtained.In order to characterize the restart of steroid biosynthesis, expression of 3 essential components of testicular steroid biosynthesis steroidogenic acute regulatory (StAR) protein, cytochrome P450 side chain cleavage (P450scc) and cytochrome P450 17alpha-hydroxylase/17,20-lyase (P450c17) was determined by qualitative and quantitative polymerase chain reaction on the mRNA level and by immunohistochemistry on the protein level. Furthermore, Leydig cells were characterized morphologically and the area of the interstitial compartment was assessed histologically.Western Blot indicated specifity of the antibodies used for immunohistochemistry; however, the apparent slight deviations in molecular masses of canine P450scc and P450c17 from the non-canine controls used, point towards a canine specific expression of these proteins. Positive immunostaining for StAR-protein, P450scc and P450c17 was restricted to Leydig cells, which showed a significantly decreased nuclear size at downregulation.According to the reduced testosterone concentrations in peripheral plasma ranging at or below the level of detection and, when compared to CG, the significantly decreased expression of StAR-protein, P450scc and P450c17 in DG A, downregulation of testicular function affects the whole cascade of steroid biosynthesis. The availability of these 3 parameters was restricted on mRNA as well as on protein level.After abolition of downregulation by implant removal restart of steroid biosynthesis occurs immediately and in a short time frame between DG A and DG B, in part showing indications of a rebound-phenomenon. Complete steroid biosynthesis was already recovered few weeks after abolishment of downregulation when recrudescence of spermatogenesis had reached the state of formation of round spermatids. Complete spermatogenesis was present 9 weeks after implant removal at the earliest.No significant differences were observed between the implants Gonazon® and Profact® Depot , but there was a tendency of Profact® Depot having a stronger effect.In the premature testes a high expression of StAR-protein-, P450scc- and P450c17 could be demonstrated on the mRNA-level, while expression on the protein level was low. Therefore expression of these proteins seems to be regulated post-transcriptionally in the premature testis.
Restart of steroid biosynthesis following downregulation of testicular function in the dog : Expression of StAR-protein, P450scc and P450c17
Keywords: Spermatogenese; Steroidogenese; GnRH-Implantat; Gonazon; Rekrudeszenz; spermatogenesis; steroidogenesis; GnRH-implant; Gonazon; recrudescence; ddc:630