Die Rolle von Autophagie und die Membrandynamik-regulierenden Proteinen im Kontext der Coronavirus-Infektion - Dort, Franziska Maria; Justus Liebig University Giessen (My University, 2026)
Humane Coronaviren (CoV) sind weit verbreitete, umhüllte RNA-Viren, welche vor allem Erkrankungen der Atemwege verursachen, die von leichten Erkältungssymptomen bis hin zu lebensbedrohlichen Komplikationen reichen können. Die weltweite Ausbreitung von SARS-CoV, MERS-CoV und SARS-CoV-2 verdeutlicht das pandemische Potential von CoV und den dringenden Bedarf an neuen innovativen antiviralen Strategien. In dieser Arbeit wurden, unter der Verwendung des HCoV-229E als Modell, Endomembran-assoziierte Prozesse und dabei beteiligte Faktoren im Kontext der Virusreplikation charakterisiert. Schwerpunktmäßig wurde der Vorgang der Autophagie untersucht, welcher die zelluläre Homöostase aufrechterhält und für die Replikation einiger Viren als essentiell gilt, während die Evidenz von Autophagie bei der Replikation von CoV zu Beginn der Arbeit unvollständig und uneinheitlich war. Dieses galt auch für die ER-Phagie, eine Unterform der Autophagie, welche zur Regulation und Adaptation des endoplasmatischen Retikulums in Stresskonditionen beiträgt. Die experimentelle Analyse des Autophagieprozesses erfolgte anhand eines fluoreszierenden Reportersystems und über mikroskopische, durchflusszytometrische und proteinbiochemische Methoden, wodurch eine umfassende Analyse der Regulation des autophagischen Fluxes unter basalen und Stress- bzw. Infektionsbedingungen ermöglicht wurde. Zusätzlich wurde eine quantitative KI-basierte Einzelzell-Auswertung etabliert, welche unabhängig, automatisiert und hochpräzise subzelluläre Strukturen in einer Vielzahl an Zellen identifizierte und auch für die Erfassung der virale dsRNA-enthaltenden replikativen Organellen sowie der (sub)zellulären Verteilung des Phosphoinositids PI(4,5)P2 genutzt wurde. In einem weiteren Ansatz wurden defiziente Zelllinien für Faktoren, welche aufgrund vorheriger Proteomuntersuchungen als an virusregulierten Endomembranvorgängen beteiligt identifiziert wurden, mittels des CRISPR-Cas9-Systems erzeugt. In zwei unterschiedlichen Zellmodellen wurde eine moderate zeitverzögerte Aktivierung des autophagischen Fluxes durch HCoV-229E und die Lokalisation des essentiellen Autophagiefaktors LC3B in dsRNA-positiven replikativen Organellen, jedoch keine Korrelation der autophagischen Aktivität mit der Bildung von dsRNA, beobachtet, während ER-Phagie zelltypabhängig gering negativ reguliert wurde. Detaillierte Quantifizierungen zeigten eine Größenzunahme von LC3B-positiven Autophagosom-ähnlichen Strukturen in infizierten Zellen und deuten auf eine Abhängigkeit der Virusreplikation von vornehmlich frühen Autophagieschritten hin. SEC24A vermittelt die Rekrutierung von Proteinen in COPII-Vesikel, die frühe Schritte der Autophagie unterstützen, und beeinflusst gleichzeitig die Toxizität des antiviralen Wirkstoffs Thapsigargin. In experimentelle Analysen von SEC24A-defizienten Zelllinien unter Thapsigargin-Behandlung zeigte sich eine Reduktion der Autophagie-hemmenden, aber nicht der antiviralen Eigenschaften des Inhibitors. Diese Befunde lieferten neue Informationen zu dem nicht vollständig beschriebenen Wirkmechanismus von Thapsigargin. Zudem wurde das Protein MURC/CAVIN-4 untersucht, welches an der Bildung von speziellen, als Caveolae bezeichneten, lipid rafts beteiligt ist. Aufgrund der transkriptionellen Induktion von MURC/CAVIN-4 während der Infektion mit HCoV-229E und unveränderter Bildung von dsRNA, bei gleichzeitiger leichter Senkung der viralen Titer nach einer Depletion des Proteins, ist eine Beteiligung von MURC/CAVIN-4 an späten Schritten der Infektion wie der Exozytose wahrscheinlich. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der Lipidkinasen PIP4K2 untersucht, welche die nicht-kanonische Modifikation des Phosphoinositids PI5P zu PI(4,5)P2 katalysieren und deren Proteinbiosynthese in HCoV-229E-infizierten Zellen, entgegen des globalen virusinduzierten translationalen Arrests, aufrechterhalten wird. Es konnte eine Anreicherung von PI(4,5)P2 in den replikativen Organellen identifiziert werden und die Depletion von mindestens zwei der drei Isoformen der Kinase (PIP4K2A/B/C) resultierte in einer Abnahme der viralen dsRNA-Bildung. Die pharmakologische Blockade von PIP4K2 durch zwei ATP-kompetitive Inhibitoren, THZ-P1-2 und CC260, zeigte starke dosisabhängige antivirale Effekte. Zusätzlich wurde eine differenzielle Modulation des autophagischen Fluxes durch beide Substanzen festgestellt, so zeigte CC260 eine leichte Induktion des Prozesses, während THZ-P1-2 zu einem ausgeprägten Arrest von späten Autophagieschritten führte einhergehend mit einer erhöhten Zytotoxizität. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein vertieftes Verständnis der Regulation von Autophagie-abhängigen Endomembranvorgängen bei der CoV-Replikation erreicht werden. Die funktionellen Daten und pharmakogenetische Perturbationsexperimente charakterisieren subzellulär angereichertes PI(4,5)P2 und die dabei beteiligten Lipidkinasen als neue, interessante Kandidaten für antivirale Interventionsstrategien auf der Ebene der infizierten Wirtszelle.
Keywords: Autophagie; Coronavirus; Phosphoinositide; SEC24; PIP4K2; ddc:610