MAP und Morbus Crohn? : Untersuchungen zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in humanen Darmgewebeproben - Nguyen, Kim Katherine; Justus Liebig University Giessen (My University, 2018)
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose, einer chronischen, nicht therapierbaren Darmentzündung bei Wiederkäuern. Insbesondere Rinder sind für eine MAP-Infektion empfänglich (Ayele et al., 2001). MAP konnte jedoch auch bei Wildwiederkäuern (Pavlik et al., 2000a), anderen Wildtieren (Beard et al., 2001a), Dipteren (Fischer et al., 2001) und sogar Primaten (Münster et al., 2013) nachgewiesen werden. Die Detektion von MAP gelang ebenfalls aus humanen Darmgewebe- und Blutproben (Chiodini et al., 1984b; Naser et al., 2004). Der Nachweis von MAP/-DNA bei Morbus Crohn-Patienten lässt eine Mitbeteiligung des Erregers am Krankheitsgeschehen vermuten. Andererseits werden zahlreiche andere Einflussfaktoren, beispielsweise Alter und genetische Prädisposition der Patienten, diskutiert (Akbariqomi und Heidari, 2014). Umstritten ist weiterhin, ob Zellwand-geschädigte Formen von MAP sogenannte Sphäroblasten an der Ätiologie des Morbus Crohns beteiligt sind.Um ein mögliches zoonotisches Potential von MAP besser abschätzen zu können, wurde eine Fall-Kontroll-Studie in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Erlangen zur Untersuchung humaner Darmbiopsate auf das Vorliegen von MAP-Zellen durchgeführt. Dafür wurden kulturelle, mikroskopische und molekular-basierte Nachweismethoden eingesetzt. Zusätzlich wurden sogenannte Resuszitationsmedien einbezogen, um der Fragestellung einer möglichen Mitbeteiligung von MAP-Sphäroblasten nachzugehen.Insgesamt wurde in 39,9 % der 203 Proben MAP-DNA mittels molekular-basierten Untersuchungsmethoden der nested PCR nach Bull et al. (2003b) zum Nachweis der IS900-Sequenz und der Triplex-PCR nach Schönenbrücher et al. (2008) zum Nachweis der Marker f57 und ISMav2 mit interner Amplifikationskontrolle detektiert. Der Nachweis von MAP-DNA aus humanen Darmbiopsaten gelang bei 47,5 % der Morbus Crohn (MC)-Patienten (38 aus 80), bei 48,1 % der Colitis ulcerosa (CU)-Patienten (26 aus 54) sowie bei 24,6 % der Kontrollpatienten ohne chronisch-entzündliche Darmerkrankung (17 aus 69). Die nested PCR wies eine höhere Nachweisrate für MAP-DNA aus humanen Darmgewebeproben als die Triplex-PCR auf und ist dieser vorzuziehen.Mit Hilfe der Resuszitationsmedien (VIB- und RAF-Medium) wurde statistisch signifikant häufiger MAP-DNA nachgewiesen als mit der MGIT-Bouillon. Demzufolge ist eine Beteiligung von MAP-Sphäroblasten nicht auszuschließen und der Einsatz von Resuszitationsmedien empfehlenswert. Jedoch konnte bei der Verwendung dieser Medien nicht unterschieden werden, ob die Anreicherung durch eine tatsächliche Resuszitation von Sphäroblasten oder durch eine Überwucherung bereits in der Probe vorliegender, intakter MAP-Zellen begründet ist.Die Nachweisrate von MAP-DNA ist in den kürzeren Inkubationszeiträumen (12 > 24 > 48 Wochen) und bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (MC und CU) statistisch signifikant höher. Das Alter und Geschlecht der Patienten, die Biopsatmasse, der beprobte Darmabschnitt wie auch der makroskopisch beurteilte Entzündungscharakter der Biopsate haben keinen Einfluss auf die Nachweisrate. Die als nicht-entzündlich mikroskopisch beurteilten Proben beeinflussten hingegen die MAP-DNA-Nachweisrate (nicht-entzündlich > entzündlich).Anhand der Färbung nach Ziehl-Neelsen mit anschließender lichtmikroskopischer Untersuchung konnten in acht von 1.218 Präparaten (0,7 %) säurefeste Stäbchen eindeutig dargestellt werden. Aufgrund der hohen Nachweisgrenze von 104 KbE/ml und der schwierigen Interpretation bei der Auswertung eignet sich die Färbemethode nicht zum Nachweis von MAP in humanen Darmgewebeproben.Aus einem CU-Patienten konnte MAP isoliert und auf Herrold s Egg Yolk Medium (HEYM) kultiviert werden, die darauffolgende Sequenzierung ergab Homologien zu anderen humanen und bovinen MAP-Stämmen. Insgesamt wurden nur in einer Probe vermehrungsfähige MAP-Zellen nachgewiesen (auf HEYM und RAF-Medium). Trotz positiver Nachweisrate von MAP-DNA bei MC- und CU-Patienten kann nicht auf die Lebensfähigkeit der Bakterien geschlossen werden und somit wiederum nicht auf eine potentielle Infektion mit MAP.Die Beteiligung von MAP am Morbus Crohn-Geschehen wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Denn zum einen liegen widersprüchliche Ergebnisse vor: In der Studie von Bull et al. (2003a) wurde MAP in 14 Darmgewebeproben (42,4 %) von MC-Patienten sowohl kulturell als auch molekularbiologisch nachgewiesen; Parrish et al. (2009) wiesen dagegen in keiner der 130 Blutproben von MC-Patienten MAP/-DNA nach. Zum anderen muss die Frage nach der Kausalität für jede Studie einzeln bewertet werden. Zahlreiche Reviews und Meta-Analysen deuten darauf hin, dass MAP als mikrobieller Trigger beim Morbus Crohn des Menschen beteiligt sein kann (Büttner et al., 2005; Rosenfeld und Bressler, 2010; Hru ka und Pavlik, 2012). Demnach ist nicht auszuschließen, dass MAP zumindest bei einer Subpopulation der Morbus Crohn-Patienten eine Rolle spielt, obgleich der Mensch für diesen Mikroorganismus anscheinend ein Fehlwirt ist. Ob MAP eine zoonotische Bedeutung besitzt oder nicht, kann mit der eigenen Studie nicht abschließend geklärt werden. Die neuen Möglichkeiten der High Throughput Experimentation (HTE) und von Big Data-Analysen werden helfen, die Rolle von MAP bei Morbus Crohn besser zu verstehen.

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) is the causative agent of paratuberculosis a chronic and untreatable intestinal inflammation of ruminants. Cattle are particularly susceptible for an infection with MAP (Ayele et al., 2001). However, MAP was also detected in wild ruminants (Pavlik et al., 2000a), other wildlife animals (Beard et al., 2001a), diptera (Fischer et al., 2001) as well as in primates (Münster et al., 2013). MAP was even detected in human intestinal tissue and blood samples (Chiodini et al., 1984b; Naser et al., 2004). The detection of MAP / MAP DNA in patients with Crohn s disease sparks a debate whether this causative agent is involved in the etiology of Crohn s disease. On the other hand, several factors can influence the disease, for example age and predisposition of the patient (Akbariqomi und Heidari, 2014). There is also a controversial discussion whether cell wall deficient MAP cells (spheroplasts) can cause Crohn s disease.A case-control study for the detection of MAP cells in human intestinal biopsies was carried out in cooperation with the university hospital in Erlangen to estimate the possible zoonotic potential of MAP. Throughout the study, culture, microscopic investigations and molecular based detection methods were applied. Additionally, resuscitation media were involved to assess the participation of MAP spheroplasts.Overall, MAP DNA was detected in 39.9 % of 203 samples via molecular biological methods. The nested PCR according to Bull et al. (2003b) for the detection of IS900 and the triplex PCR according to Schönenbrücher et al. (2008) for the detection of f57 and ISMav2 including an internal amplification control were applied. 38 patients with Crohn s Disease (CD; 47.5 %), 26 with ulcerative colitis (UC; 48.1 %) and 17 control patients without any inflammatory bowel disease (24.6 %) were MAP DNA positive. The detection rate for MAP DNA was higher with nested PCR than triplex PCR. Therefore, nested PCR is the preferred method.MAP was detected statistically significantly more frequent by using the resuscitation media VIB and RAF than the MGIT bouillon. Hence, a participation of MAP spheroplasts may be possible. Although the use of resuscitation media is recommendable, it could not be differentiated whether the accumulation of MAP was caused by an actual resuscitation of spheroplasts or by overgrowth of pre-existing cell wall competent forms.The detection rate of MAP DNA is statistically significantly higher in the 12th and 24th week of incubation than after 48 weeks and increases significantly in patients with inflammatory bowel diseases like CD or UC. Certain parameters do not influence the detection rate like age and gender of the patients, the sample weight and intestinal section as well as the type of inflammation which was determined macroscopically. However, the type of inflammation which was determined microscopically affects the detection rate (not-inflammable > inflammable).Acid-fast bacilli were detected in eight of 1,218 slides (0.7 %) after staining with Ziehl-Neelsen and light microscopic investigation. This staining method is not recommended for the detection of MAP in human intestinal samples due to the high detection limit (> 104 cfu/ml) and the difficult interpretation.MAP was isolated from a patient with UC and showed colony growth on Herrold s egg yolk medium (HEYM). This MAP isolate was homologue to other human and bovine MAP strains demonstrated by sequencing. Overall, viable MAP cells were detected in just one sample (on HEYM and RAF medium). The positive detection rate of MAP DNA in patients with CD and UC however does not indicate the viability of the bacteria and, consequently, not a potential infection with MAP.The role of MAP in Crohn s disease is subject of controversial discussion. Firstly, there are contradictory study results: Bull et al. (2003a) were able to detect MAP in 14 intestinal samples of CD patients (42.4 %) via culture and molecular based methods; Parrish et al. (2009) however, did not detect MAP / MAP DNA in any of the investigated 130 blood samples of CD patients. Secondly, the question of causality has to be assessed in each study independently. Numerous reviews and meta-analyses indicate that MAP might be involved as a microbial trigger in Crohn s disease (Büttner et al., 2005; Rosenfeld und Bressler, 2010; Hru ka und Pavlik, 2012). Therefore, a possible involvement of MAP in a subpopulation of CD patients cannot be ruled out although human hosts seem to be accidental hosts for this particular microorganism. The question whether MAP acts as a zoonotic agent or not cannot be conclusively determined by this study. However, recent advances in High Throughput Experimentation (HTE) as well as Big Data Analytics might be beneficial in helping to understand the role of MAP in Crohn s disease.
Keywords: ddc:630