Calcium-induzierte Chloridsekretion an isolierten Krypten aus dem Kolon der Ratte - Hennig, Britta; Justus Liebig University Giessen (My University, 2007)
Calciumaktivierte Chloridkanäle (CaCC) spielen in vielen Epithelien eine wichtige Rolle. Nachdem ein CaCC auch am Kolonepithel der Ratte funktionell nachgewiesen werden konnte, war es Ziel dieser Arbeit diesen genauer zu untersuchen. Dabei sollte überprüft werden, wie stark die über den CaCC vermittelte Änderung der intrazellulären Chloridkonzentration & #916; [Cl-]i ist und ob sich die Amplitude über die Kryptenachse verändert. Außerdem sollte der Weg der Signaltransduktion ermittelt werden. Unter depolarisierten Bedingungen und nach Anlegen eines chemischen Gradienten für Chlorid war es möglich durch Stimulation mit Carbachol eine CaCC getragene Absenkung der [Cl-]i mittels Imaging-Technik zu messen. Dazu wurde der halogenidsensitive Farbstoff MEQ verwendet. Der Chloridausstrom war stilbensensitiv und konnte mit dem Calcium-Ionophor Ionomycin nachgeahmt werden. Der Differenzierungsgrad der Epithelzellen spiegelt sich in der Amplitude der Carbacholantwort nicht wider. Die Signalweiterleitung wird nicht von den klassischen Calcium-assoziierten Kaskaden vorgenommen. Vielmehr müssen alternative Signalwege eine Rolle spielen. Anscheinend ist NO als second messenger in diesen Signalweg einbezogen, da über den NO-Donor Nitroprussid eine dem Carbacholeffekt ähnlich Zellantwort ausgelöst werden konnte. Zusätzlich hemmte L-NMMA, ein Blocker der NOS-Subtypen, die Carbachol-induzierte Chloridsekretion. L-NNA, ebenfalls ein Inhibitoren von NOS konnte die Carbacholantwort der Krypten nicht blockieren. Da L-NNA eine deutlich schwächere Wirksamkeit auf die i-NOS besitzt, indiziert dies eine Beteiligung dieses NOS-Subtyps. Mittels immunhistochemischer Methodik wurde das Verteilungsmuster der NOS-Subtypen im Kolonepithel untersucht. Hierbei zeigte sich, dass vor allem die i-NOS und die n-NOS sehr präsent und entlang der gesamten Kryptenachse zu finden sind. Die e-NOS hingegen wird wesentlich schwächer exprimiert und konzentriert sich auf die Oberflächenregion. Als Vermittler zwischen dem Anstieg des cytoplasmatischen Calciums und den NOS fungiert möglicherweise das Cytoskelett. Nocodazol und Colchicin zerstören die Mikrotubuli und reduzierten den Carbachol-induzierten Chloridefflux signifikant. Jasplakinolide, welches das Actinskelett versteift, indem es die Depolymerisation des F-Actins verhindert, hemmte ebenfalls den Chloridefflux. Somit scheint sowohl ein intaktes Netzwerk der Mikrotubuli, als auch ein intaktes Actincytoskelett zu Aktivierung des CaCCs erforderlich zu sein.

Ca2+-activated Cl- channels (CaCCs) play an important role in numerous epithelia. As the existence of a CaCC has been shown functionally at the colonic epithelium of the rat, the aim of this study was to characterize its role during Ca2+-dependent Cl- secretion evoked by the stable acetylcholine derivative, carbachol. With the imaging technique using the halide-sensitive dye, MEQ, it was possible to measure a carbachol-stimulated decrease in intracellular Cl- concentration (Δ [Cl-]I) under depolarized conditions in the presence of a chemical gradient for Cl-. The efflux of Cl- was sensitive against stilbenes and could be mimicked by the calcium ionophore, ionomycin. The degree of cellular differentiation did not affect the amplitude of the carbachol response. Classical Ca2+ involving cascades do not transduce the signal. Rather alternative pathways have to play a role. Apparently, NO is involved as a second messenger as sodium nitroprusside, a NO donor, mimicked the carbachol response. In adddition, L-NMMA, a blocker of the NO-synthases (NOS) inhibited the carbachol response. Another blocker of NOS, L-NNA, was ineffective. Since L-NNA is a only poor blocker of the i-NOS, this result suggests a participation of this NOS-isoform in the signaling cascade. The pattern of distribution of the three NOS-isoforms was examined by immunohistochemistry. It was shown that the i-NOS and the e-NOS are present all over the crypt axis. In contrast, the n-NOS is expressed in a weaker manner and is concentrated on the top of the crypt. Intermediary between the increase of the intracellular Ca2+ concentration and the NOS may be the cytoskeleton. Both nocodazol and colchicine reduced the carbachol-induced Cl- efflux significantly. Jasplakinolide, which stiffens the cytoskeleton by inhibiting the deploymerisation of the F-actin, also blocked the Cl--efflux. Thus, for activating the CaCC both a functional microtubule network as well as a functional actin cytoskeleton seem to be required.
Keywords: ddc:630