Untersuchungen betreffend Annexin IX bei Manduca sexta und anderen Lepidopteren : Vorkommen und mögliche Funktionen - Klang, Manuel T.; Justus Liebig University Giessen (My University, 2008)
In der vorliegenden Arbeit wurde über einen für Manduca sexta Annexin IX spezifischen monoclonalen Antikörper (Antikörper #78) ein Vorkommen von Annexin IX in diversen Lepidopteren nachgewiesen. Neben den bisher bekannten unterschiedlichen Nachweisen von Annexin IX in Manduca sexta und Bombyx mori wurde Annexin IX in Acherontia atropos, Hyalophora cecropia, Actias artemis und Galleria mellonella gefunden und dokumentiert. Zusätzlich gelang es für Acherontia atropos, den Nachweis von Annexin IX über RT-PCR zu bekräftigen. Weiterhin wurde der Antikörper eingesetzt, um ein Vorkommen von Annexin IX in Hämocyten und die Veränderung über die Zeit während des Anheftungsvorganges der Zellen sichtbar zu machen. Es wurde eine Zunahme der markierten Zelloberfläche während des Vorganges festgestellt. Ausserdem konnte beobachtet werden, dass eine Parasitisierung mit Cotesia congregata negative Auswirkungen auf die Grösse der markierten Fläche hatte, während Annexin IX selbst innerhalb der Zelle vorhanden blieb. Daher wurde der Schluss gezogen, dass Annexin IX am Vorgang der Einkapselung innerhalb einer Reaktionskette beteiligt sein könnte. Ebenfalls über den Antikörper wurde der optische Nachweis von Annexin IX im KLSM in Nervengewebe, Tracheen, Fettkörper, Malpighi schen Gefässen, Spinndrüsen und weiteren Organen erbracht und durch Western-Blot bekräftigt. Den optischen Schnitten folgend kommt Annexin IX in den Organen hauptsächlich in den umhüllenden äußeren Bereichen vor. Bei Malpighi schen Gefässen und Speicheldrüsen allerdings scheint Annexin IX auch im Organinneren vorzukommen. Da es mit Hilfe des verwendeten Antikörpers nicht möglich war, zwischen den drei vermuteten Isoformen von Annexin IX zu differenzieren, wurde der Vorgang der RT-PCR genutzt, da sich die erwarteten Fragmente der jeweiligen Isoformen theoretisch in der Länge unterscheiden. Es wurden in den meisten Organen drei Fragmente gefunden, die allerdings jeweils kürzer als erwartet waren. Eine Sequenzanalyse und anschließender Sequenzvergleich ergab, dass es sich bei den Fragmenten um Annexin IX Sequenzen handelte, die allerdings nicht an den bisher erwarteten Splice-Sites verknüpft waren. Eine erneute Berechnung der möglichen Lage Introns und Exons ergab mehrere Möglichkeiten, von denen je eine pro Isoform die vorliegenden Ergebnisse zu erklären vermochten. Eine Translation der auf diese Weise erhaltenen Nukleotidsequenzen brachte drei Aminosäuresequenzen hervor, die sich als Annexin IX identifizieren liessen. Daher kann davon ausgegangen werden, dass andere Splicing-Sites als bisher erwartet bei Manduca sexta Annexin IX genutzt werden.

This work shows an occurence of Annexin IX in diverse Lepipoptera by using a specific monoclonal antibody for Manduca sexta Annexin IX. Beside the known detection of Annexin IX in Manduca sexta and Bombyx mori this protein was found in Acherontia atropos, Hyalophora cecropia, Actias artemis and Galleria mellonella. In addition to that it was possible to proof the occurrence of Annexin IX in Acherontia atropos by RT-PCR. Furthermore the monoclonal antibody was used to document Annexin IX in hemocytes of Manduca sexta and changes during adhesion of these cells were shown as well as the influence of the parasitoid Cotesia congregata on the size of the marked areas on the surface of the cell, while the protein was still abundand in the cell. This leads to the conclusion, that Annexin IX could be part of a pathway of encapsulation. Also by using the monoclonal antibody the optical evidence of Annexin IX in several organs of Manduca sexta was adducted via CLSM and confirmed by western blot. In the optical section Annexin IX s occurrence is located on the surface of the organs with exception of Malpighian tubules and salivary glands. In these organs the protein was detected inside the organs, too. Because it wasn t possible to distinguish the three assumed isoforms by the used antibody, RT-PCR was used, since the three isoforms are supposed to vary in length. The samples of most organs indeed brought three fragments, but these were shorter than expected. The analysis of these sequences confirmed the identification as Annexin IX, but gave hints to the use of different splicing sites as assumed. The calculation of possible splicing sites brought three amino acid sequences that were identified as isoforms of Annexin IX.
Studies according Annexin IX in Manduca sexta and other lepidopterans : occurence and possible functions
Keywords: Manduca sexta; Annexin IX; alternatives Splicen; Hämocyten; Adhäsion; Manduca sexta; annexin IX; alternative splicing; hemocytes; adhesion; ddc:570