Identifikation der Interaktionsdomäne von Galektin-8 und K-Ras4B sowie der Einfluss von Galektin-8 auf Ras-abhängige Signalwege in Tumorzellen - Meinohl, Christopher; Justus Liebig University Giessen (My University, 2020)
Die vier Ras-Isoformen H-Ras, N-Ras, K-Ras4A sowie K-Ras4B gehören zur Familie der Ras-Proteine. Diese Membran-assoziierten monomeren GTPasen wechseln zwischen einem GTP-gebundenen, aktiven und einem GDP-gebundenen, inaktivem Zustand. Das aktive GTP-gebundene Ras-Protein vermittelt an der Plasmamembran eine Aktivierung von Effektorproteinen, die über verschiedene Signalwege Proliferation, Migration, Differenzierung, Überleben und Transformation von Zellen beeinflussen. Die intrinsische und die durch GTPase-aktivierende-Proteine(GAP)-vermittelte GTPase Aktivität von Ras liegt in vielen bekannten, onkogenen Ras-Mutanten stark reduziert vor, sodass Ras im GTP-gebundenen Zustand an der Plasmamembran verbleibt und dort unkontrolliert Effektor-Signalwege aktiviert. In Pankreas- und Lungenkarzinomen liegt das KRAS-Onkogen prädominant mutiert vor. Versuche, onkogenes K-Ras zu inhibieren oder die Lokalisation von K-Ras zu verändern waren aufgrund der Toxizität bzw. Ineffektivität der pharmakologischen Inhibitoren erfolglos. Galektin-8 wurde in unserer Arbeitsgruppe als ein neuer Interaktionspartner von K-Ras4B beschrieben. In früheren Analysen konnte die N-terminale carbohydrate recognition domain (CRD) von Galektin-8 bereits als interagierende Domäne mit K-Ras identifiziert werden. Um die Bedeutung der Farnesylierung von K-Ras4B für die Interaktion mit Galektin-8 zu analysieren, wurden Farnesyldomänen-Mutanten von K-Ras4B ektop exprimiert und in vitro-Interaktionsstudien mit endogenem Galektin-8 aus PANC-1-Lysaten durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass farnesyl-defizientes K-Ras4B nicht mit Galektin-8 interagiert. Weiterhin wurde der Einfluss der positiv-geladenen Lysine im C-Terminus von K-Ras4B auf die Interaktion mit Galektin-8 untersucht. Lysine an den Positionen 182 bzw. 184 in der Aminosäuresequenz von K-Ras4B wurden gegen Serin bzw. Prolin ausgetauscht. Es zeigte sich, dass bei einer Mutation beider Lysine an den Positionen 182 und 184 die Interaktion mit Galektin-8 eingeschränkt ist. Werden darüber hinaus zusätzlich die Lysine innerhalb der polybasischen Domäne von K-Ras4B mutiert, so kommt es zu einem nahezu vollständigen Verlust der Interaktion der beiden Proteine. Im Gegensatz zur Interaktion von Galektin-1 und Galektin-3 mit Ras-Proteinen ist die Interaktion von Galektin-8 mit K-Ras4B unabhängig von dem gebundenen Guaninnukleotid. Weitere GTPasen, wie Rac1, Rac1b und Cdc42, die posttranslational geranylgeranyliert vorliegen, konnten in in vitro-Interaktionsstudien ebenfalls als Interaktionspartner von Galektin-8 identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass Lysine in unmittelbarer Nähe des prenylierten Cysteins erneut einen stabilisierenden Einfluss auf die Interaktion dieser GTPasen mit Galektin-8 haben. Auf Basis dieser Erkenntnisse wurden Strukturanalysen in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Karin Fritz-Wolf (Institut für Ernährungswissenschaften, Gießen) erstellt. Es konnte eine hydrophobe Tasche innerhalb der N-CRD von Galektin-8 identifiziert werden, die ein negativ-geladenes Aminosäure-Cluster enthält, welches mit der polybasischen Domäne von K-Ras elektrostatisch interagieren und somit die Interaktion zwischen den beiden Proteinen stabilisieren könnte.Untersuchungen zu den Effekten eines siRNA-vermittelten knockdowns von Galektin-8 auf den Ras/Raf/MEK/ERK-Signalweg, zeigten, dass der Proteingehalt von EGFP-K-Ras(G12V) nach knockdown von Galektin-8 zunimmt. Ebenfalls konnte eine erhöhte Phosphorylierung von ERK1/2 nachgewiesen werden, welche durch den Anstieg des Proteingehaltes von EGFP-K-Ras(G12V) begründet sein könnte. Analysen hinsichtlich des PI3K/Akt-Signalwegs zeigten, dass nach einem knockdown von Galektin-8 der Proteingehalt von Akt sowie die Phosphorylierung von Akt verringert ist. Über Akt-Isoform-spezifische Antikörper konnte nachgewiesen werden, dass die Akt-Isoform Akt2 als einzige der drei analysierten Akt-Isoformen nach Galektin-8 knockdown reduziert vorliegt. Die Depletion von Galektin-8 führte außerdem zu einer Reduktion der Migrations- und Proliferationsrate von PANC-1-Zellen. Des Weiteren zeigten Immunfluoreszenz-Analysen, dass Galektin-8 mit K-Ras an der Plasmamembran ko-lokalisiert. Es konnte an einigen der analysierten Strukturen eine Ko-Lokalisation von Gal-8 mit Rab7 sowie eine Ko-Lokalisation von Galektin-8 mit Rab11 an Late- und Recycling-Endosomen detektiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig die direkte Interaktion von K-Ras und Galektin-8 nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass die Interaktion von K-Ras und Galektin-8 abhängig von der Farnesylierung von K-Ras, den Lysinen 182 und 184 am C-Terminus von K-Ras sowie abhängig von der polybasischen Domäne von K-Ras ist. Weiterhin konnte dargestellt werden, dass Galektin-8 die beiden bedeutenden, tumorrelevanten Signaltransduktionswege Ras/Raf/MEK/ERK sowie den PI3K/Akt beeinflusst und bei Depletion zu einer Reduktion der Migration und Proliferation von PANC-1-Zellen führt. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Daten weisen weiterhin darauf hin, dass Galektin-8 als Chaperon-ähnliches Transportprotein K-Ras von der Plasmamembran oder von endosomalen Strukturen extrahieren und im Folgenden zur proteasomalen Degradation geleiten könnte.

The four Ras proteins H-Ras, N-Ras, K-Ras4A as well as K-Ras4B belong to the family of Ras proteins. These membrane-associated monomeric GTPases cycle between a GTP-bound, active and a GDP-bound, inactive state. The active, GTP-bound Ras-proteins mediate the activation of downstream effector proteins, thereby influencing processes like proliferation, migration, differentiation, survival and transformation. The intrinsic and the GTPase-activating protein (GAP)-mediated GTPase activity of Ras is reduced in many Ras-mutants rendering the proteins in a predominantly GTP-bound state which subsequently lead to a permanent activation of downstream signal transduction pathways.The KRAS-oncogene is frequently mutated in many pancreatic and lung carcinoma cells. Many approaches to directly inhibit oncogenic Ras or target its localization at the plasma membrane fail due to the high toxicity and low efficiency of diverse pharmacological inhibitors.Our group identified Galectin-8 as a novel interaction partner of K-Ras4B. Previous studies revealed that the N-terminal carbohydrate recognition domain (CRD) of Galectin-8 interact with K-Ras4B. To identify the role of the farnesylation of K-Ras4B in mediating the interaction with Galectin-8, in vitro interaction assays with farnesyl-domain mutants of K-Ras were performed. Therefore, these mutants were expressed ectopi- cally and subsequently incubated with endogenous Galectin-8 isolated from PANC-1-cells. It was shown, that farnesyl-deficient K-Ras4B was not able to interact with Galectin-8. Furthermore, the impact of the positively charged lysines in close proximity to the C-terminus of K-Ras4B were analyzed regarding their influence on the interaction with Galectin-8. Furthermore, the impact of the positively charged lysines in close proximity to the C-terminus of K-Ras4B were analyzed regarding their influence on the interaction with Galectin-8. Lysines at position 182 and 184, respectively, were replaced by serine and proline. By mutating both lysines the interaction with Galectin-8 was impeded. Mutating further lysines within the polybasic domain of K-Ras4B led to an almost complete loss of the interaction between both proteins. In contrast to the interaction of Galectin-1 or Galectin-3 with Ras-proteins, the interaction of Galectin-8 and K-Ras4B is independent of the type of bound guanine nucleotide. Further in vitro interaction assays revealed, that other GTPases, like Rac1, Rac1b and Cdc42, which are posttranslationally geranylgeranylated, also interact with Galectin-8. Again, lysines close to the prenylated cysteine might stabilize the interaction between the respective GTPase and Galectin-8. Based on these studies, structure analyses were performed in cooperation with Dr. Karin Fritz-Wolf (Institute of Nutritional Sciences, Giessen). We identified a hydrophobic pocket within the N-CRD of Galectin-8 containing a cluster of negatively charged amino acids, which might interact electrostatically with the polybasic domain of K-Ras, thereby stabilizing the interaction between both proteins.Additionally, siRNA-mediated depletion experiments were performed to elucidate possible effects of a knockdown of Galectin-8 on the Ras/Raf/MEK/ERK pathway. The protein content of EGFP-K-Ras(G12V) was increased after depletion of Galectin-8. Furthermore, the phosphorylation of ERK1/2 was enhanced, which might be caused by the elevated amounts of EGFP-K-Ras(G12V). Analyses of the PI3K/Akt signaling pathway showed, that the protein amounts as well as the phosphorylation levels of Akt were reduced after Galectin-8 depletion. By using Akt-isoform-specific antibodies, it was discovered, that only the protein levels of Akt2 but not that of Akt1 or Akt3 was reduced upon depletion of Galectin-8. A knockdown of Galectin-8 also led to a reduction of the migration and proliferation rate of PANC-1-cells. Immunofluorescence studies showed, that Galectin-8 co-localizes with K-Ras in PANC-1-cells. Furthermore, a co-localization of Galectin-8 with the endosomal marker proteins Rab7 as well as Rab11 on late and recycling endosomes was revealed, respectively.The studies performed in the scope of this work uncovered a novel direct interaction of K-Ras with Galectin-8. This interaction depends on the farnesylation of lysine residues 182 and 184 located at the C-terminus of K-Ras within the polybasic domain. Furthermore, the data presented in this work revealed an influence of Galectin-8 on the tumor-relevant pathways Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/Akt. Moreover, a depletion of Galectin-8 led to a reduction of the migration and proliferation rate of PANC-1-cells. Altogether, the data obtained in this work indicate a role of Galectin-8 as a chaperonlike transport protein, which might extract K-Ras from the plasma membrane or other endomembranes leading to its subsequent transport from these compartments towards the proteasomal degradation machinery.
Identifying the interaction domain of Galectin-8 and K-Ras4B and the influence of Galectin-8 on Ras-dependent signal transduction in tumor cells
Keywords: ddc:570