Entwicklung von chemisch polysialylierten Makromolekülen zum potenziellen Einsatz gegen zytotoxische extrazelluläre Histone und Nukleosomen - Dambon, Jan Andreas; Justus Liebig University Giessen (My University, 2020)
Neutrophile Granulozyten sind in zahlreichen Immunprozessen involviert. Ein erst 2004 im Detail beschriebener Abwehrmechanismus gegen infiltrierende Pathogene stellen die neutrophilen extrazellulären Fallen dar (NETs). Hierbei bilden Neutrophile Granulozyten Netzwerke aus dekondensierter DNA bestückt mit Histonen und vielfältigen antimikrobiellen Substanzen, welche in den Extrazellularraum ausgeschüttet werden. Die Bildung von NETs wird mittlerweile mit einer Vielzahl an Erkrankungen in Zusammenhang gebracht (wie bspw. Sepsis oder akutes Lungenversagen), wobei der Hauptteil der Zytotoxizität aus der Akkumulation extrazellulärer Histone resultiert.Das Polysaccharid Polysialinsäure (PolySia) stellt einen natürlichen Antagonisten dieser Histon-vermittelten Zytotoxizität dar. Am Vorbild polysialylierter Trägermoleküle wurden innerhalb dieser Arbeit polysialylierte Transferrin- und Nanopartikel-Konjugate entwickelt. Da Sialidasen gehäuft in NET-Formationen vorkommen, wurde bei der Glykosylierung das nicht-reduzierende Ende dieser Homopolymere geschützt. Dies war durch Oxidation der terminalen Sialinsäure und unmittelbarer reduktiver Aminierung an die Trägermoleküle möglich. Die Oxidation wurde chromatographisch mittels DMB-Markierung und HPLC-Analyse bestätigt. Der Kopplungserfolg konnte zunächst qualitativ mittels Western Blot nachgewiesen werden. Anschließend erfolgte die Quantifizierung des Sialylierungsgehalts des polysialylierten Transferrins. Hierfür wurden die gekoppelten PolySia hydrolytisch abgespalten und ebenso chromatographisch gemessen.Darüber hinaus wurden die polysialylierten Glykokonjugate mit 5B8-Zellen inkubiert und deren Zytotoxizität mittels LDH-Assay untersucht. Die kovalent gebundenen PolySia-Ketten waren dazu in der Lage, die Histon-vermittelte Zytotoxizität stärker als native PolySia zu reduzieren.Zudem wurden PolySia tragende Nanopartikel entwickelt, um das Bindungsverhalten polysialylierter Makromoleküle an NET zu charakterisieren. Die polysialylierten Nanopartikel akkumulierten wesentlich stärker an den NET-Formationen, sodass eine spezifische Bindung angenommen werden kann. Somit könnten sich PolySia-Ketten als molekularer Anker zur Akkumulation von aktiven Substanzen an NET-Formationen nutzen.

Neutrophils are involved in numerous immunological events. One mechanism of neutrophils to combat pathogens is the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Thereby, neutrophils use DNA fibers to form a meshwork of DNA and histones as well as several antimicrobial components to trap and kill invaders. However, the formation of NETs can lead to pathological conditions triggering among other things (e.g., sepsis or acute lung failure), which is mainly a consequence of the cytotoxic characteristics of accumulated extracellular histones. The carbohydrate polysialic acid (polySia) represents a naturally occurring antagonist of the cytotoxic properties of extracellular histones. Inspired by polysialylated vesicles, we developed polysialylated nanoparticles. Since sialidases are frequently present in areas of NET formation, we protected the sensitive non-reducing end of these homopolymers. To this end, the terminal sialic acid residue of the non-reducing end was oxidized and directly coupled to transferrin and nanoparticles. Oxidation was confirmed via DMB-labelling and subsequent HPLC analysis. Furthermore the degree of sialylation was measured by hydrolyzation of the polySia-residues and chromatographic analysis. After that the polysialylated glycoconjugates were incubated with 5B8-cells and histones. The cytotoxicity was measured by LDH-assays. The covalently linked sialidase-resistant polysialic acid chains neutralize histone-mediated cytotoxicity more efficient than native polySia acid chains.In addition, polySia carrying nanoparticles were developed to characterize the binding of polysialylated macromolecules to NET. We observed via fluorescent microscopy, that the polysialylated particles bind to the NET filaments. Thus, polySia chains might act as an anchor to accumulate nanoparticles loaded with active substances in areas of NET formation.
Development of chemically polysialylated macromolecules for potential use against cytotoxic extracellular histones and nucleosomes
Keywords: Polysialinsäure; Polysialylierung; neutrophile extrazelluläre Fallen; NETose; neutrophile Granulozyten; polysialic acid; polysialylation; neutrophil extracellular traps; NETosis; neutrophil granulocytes; ddc:610