Charakterisierung ionotroper purinerger Rezeptoren im Nucleus medianus praeopticus des anterioren Hypothalamus der Ratte - Hitzel, Norma; Justus Liebig University Giessen (My University, 2009)
Der Hypothalamus stellt eine reziprok mit dem Limbischen System sowie zahlreichen pontinen und medullären Kerngebieten vernetzte, phylogenetisch archaische Komponente des Diencephalon dar und gilt als dem vegetativen Nervensystem übergeordnetes primäres Regelzentrum für die Homöostase wichtiger Körperfunktionen. Als Bestandteil der den anterioren Hypothalamus rostral begrenzenden Lamina terminalis spielt der Nucleus medianus praeopticus (MnPO) eine vorrangige Rolle bei der Integration afferenter Signale bezüglich der Konstanthaltung von Körperkerntemperatur und Salz- und Wasserhaushalt der extrazellulären Körperflüssigkeit. Zudem ist er integraler Bestandteil der Regulation des Schlaf-/Wachverhaltens und in geringerem Maße auch an der Steuerung der Nahrungsaufnahme beteiligt. Zahlreiche Studien deuten daraufhin, dass ionotrope (P2X) und metabotrope (P1 und P2Y) sog. purinerge Rezeptoren (= Purinozeptoren) mit ATP, ADP, UTP und/oder Adenosin als endogenen Liganden auf der neuroanatomischen Stufe des Hypothalamus eine wesentliche Rolle als Transmitter bei der schnellen Neurotransmission im Rahmen dieser autonomen, neuronalen Regelkreise spielen. Die funktionelle Expression purinerger Rezeptoren im Bereich des MnPO ist in der Literatur bislang nicht beschrieben; daher erfolgte in der vorliegenden experimentellen Arbeit eine detaillierte pharmakologische, molekularbiologische sowie immunhisto- und immuncytochemische Charakterisierung ionotroper Purinozeptoren im MnPO. (1) Hinsichtlich der Expression verschiedener Purinozeptor-Subtypen der P2X-Familie (P2X1 P2X7) im Bereich des MnPO konnten mittels QRT-PCR geringfügige ontogenetische Unterschiede zwischen neonatalen und adulten Tieren demonstriert werden. So ergab die quantitative Analyse, dass für das MnPO-Parenchym neona-taler Ratten vor allem die mRNAs für P2X2 und P2X4, gefolgt von P2X7 und P2X6, vorrangig nachweisbar waren, bei marginaler Expression der Subtypen P2X3 und P2X5. Im MnPO adulter Tiere hingegen zeigte P2X4, gefolgt von P2X7 und P2X3, die höchsten Expressionsraten. (2) Immunhistochemisch konnte in coronalen Gehirnschnitten transkardial perfusions-fixierter, adulter Ratten die Expression der Purinozeptor-Subtypen P2X1 und P2X2 in Neuronen, teilweise auch Astrocyten des MnPO, sowie P2X4 in perivasculären Mikrogliazellen detektiert werden. Der Zelltyp-spezifische Nachweis für die Expression spezifischer P2X-Purinozeptor-Subtypen wurde zudem durch die Etablierung einer MnPO-Primärkultur aus Gehirnen neonataler Ratten durch immuncytochemische Mehrfachmarkierungen ermöglicht. P2X1-Purinozeptoren wurden von zahlreichen MnPO-spezifischen Neuronen, Astrocyten sowie Oligodendrocyten, nicht jedoch Mikrogliazellen exprimiert, wohingegen der P2X2-Rezeptor-Subtyp vorrangig in Neuronen sowie vereinzelten Astrocyten nachweisbar war. Der P2X4-Purinozeptor wurde ausschließlich in Mikrogliazellen immuncytochemisch nachgewiesen.(3) In pharmakologischen Studien an Neuronen, Astrocyten und Oligodendrocyten der etablierten MnPO-Primärkultur, welche für die kontinuierliche Analyse der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]iz) mit dem Calciumchelator Fura-2 beladen wurden, wurde durch den Einsatz unterschiedlicher, oft Rezeptor-Subtyp spezifischer Agonisten und Antagonisten das Profil ionotroper purinerger Rezeptoren auf Einzelzellniveau mikrospektrofluorimetrisch charakterisiert. Mikrogliazellen mußten aufgrund marginaler zellulärer Fura-2 AM Aufnahme von der Studie ausgeschlossen werden. Als wichtigster, genereller Agonist für die Aktivierung eines Calciumstromes durch alle P2X-Purinozeptoren wurde neben ATP das 2Me-SATP-Analog in Superfusions-Stimulationsexperimenten eingesetzt.(a) Neurone der MnPO-Primärkultur zeigten bei Superfusions-Stimulation mit 2Me-SATP (10-8 - 10-6 M/L) hinsichtlich der [Ca2+]iz keine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung, welche bei Astrocyten und Oligodendrocyten eindeutig nachweisbar war. Während für Neurone und Oligodendrocyten der Agonist-induzierte Calciumstrom vollständig von extrazellulär erfolgte, muss für Astrocyten die zusätzliche Beteiligung intrazellulärer Speicher angenommen werden.(b) Die meisten Neurone der MnPO-Primärkultur demonstrierten einen raschen Anstieg der Agonist-induzierten Calciumsignale ohne Desensibilisierungs-Effekte, sowie den Nachweis einer Erhöhung der [Ca2+]iz ohne Dekrement bei repetitiver, äquimolarer 2Me-SATP Stimulation mit selbst kurzen Zeitintervallen. In vielen Zellen der Neuroglia hingegen konnte schon während der Superfusions-Stimulation eine Densensibilisierung der entsprechenden Purinozeptoren verzeichnet werden. Darüber hinaus konnte die Responsivität gegenüber repetitiver Stimulation durch eine Verlängerung der Zeitintervalle zwischen aufeinander folgenden Agonist-Applikationen für Astrocyten und Oligodendrocyten positiv beeinflusst werden.(c) In keiner der drei Zellgruppen der MnPO-Primärkultur konnte durch P2X1/P2X3 -spezifische (alphabetame-ATP), P2X7-spezifische (Bz-ATP) sowie Adenosinrezeptor-spezifische (NECA, CCPA) Agonisten ein intrazelluläres Calciumsignal ausgelöst werden. (d) In Gegenwart zweiwertiger Zn2+-Ionen (10-5 M/L) als allosterische Modulatoren erfolgte eine Potenzierung des durch 2Me-SATP induzierten Calciumstroms bei Neuronen, sowie eine partielle Hemmung der [Ca2+]iz bei Astrocyten und eingeschränkt auch Oligodendrocyten. Alle drei Zelltypen der MnPO-Primärkultur wiesen eine Hemmung der Agonist-induzierten intrazellulären Calciumsignale durch die Purinozeptor Antagonisten mit folgender Potenz-Hierarchie auf: RB2 > TNP-ATP = PPADS. (4) Proinflammatorische Zytokine wie TNF-alpha; oder IL-6 werden in erster Linie von Mikroglioazellen und/oder Astrocyten exprimiert. Die Inkubation der MnPO-Primärkulturen mit ATP oder 2Me-SATP induzierte sowohl zeit- als auch konzentrationsabhängig eine Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine TNF-alpha und IL-6 ins Kulturmedium, wie durch Zytokin-spezifische Bioassays ermittelt. Darüber hinaus konnte die durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) stimulierte Zytokinsekretion in Gegenwart der Purinozeptor Antagonisten PPADS oder TNP-ATP partiell unterdrückt werden. (5) Für Neurone des MnPO der Ratte kann aufgrund der durch QRT-PCR sowie Immunhisto- und cytochemie ermittelten Expressionsmuster purinerger Rezeptor-Subtypen, sowie der detaillierten Charakterisierung der exprimierten Purinozeptoren die Prävalenz eines funktionellen P2X2-Rezeptors postuliert werden. Zellen der Neuroglia könnten neben dem P2X2-Rezeptor Purinozeptoren mit P2X1-ähnlicher Charakteristik sowie metabotrope purinerge Rezeptoren wie etwa P2Y1 funktionell exprimieren. An Mikrogliazellen des MnPO schließlich vermag endogenes ATP, P2X4-Purinozeptor vermittelt, proinflammatorische Zytokine wie TNF-alpha oder IL-6 freizusetzen.

The hypothalamus represents a phylogenetically archaic component of the dienceph-alon, which is reciprocally interconnected with the Limbic system as well as numerous pontine and medullary nuclei. Functionally it acts as the main supraspinal headmaster to control and regulate the autonomic nervous system with the aim to maintain homeostasis of important body functions. As an integral component of the lamina terminalis bordering the anterior hypothalamus, the median preoptic nucleus (MnPO) plays an eminent role in integrating afferent signal information important for the maintenance of body core temperature and extracellular fluid homeostasis. In addition, the MnPO contributes to the regulation of the wake-sleep cycle and is at least partially involved in the complex hypothalamic network controlling food intake.Numerous studies strongly indicate, that ionotropic (P2X) and metabotropic (P1 and P2Y) purinergic receptors (= purinoceptors), using ATP, ADP, UTP or adenosine as endogenous ligands, play a significant role as transmitters for fast neurotransmission at the level of hypothalamic nuclei involved within the above mentioned autonomic circuitries. Functional expression of purinergic receptors within the MnPO has not been demonstrated yet. Therefore the thesis presented dealt with the detailed pharmacological, molecular biological and immunocytochemical characterization of ionotropic purinoceptors of MnPO origin.(1) With regard to the expression of various purinoceptor subtypes of the P2X family within the MnPO, quantitative RT-PCR analysis revealed minor differences between the expression patterns derived from MnPO tissues of neonatal versus adult animals. The MnPO parenchyma of neonatal rats primarily contained mRNAs coding for P2X2 and P2X4, followed by P2X7 and P2X6, with marginal expression of the subtypes P2X3 and P2X5. Within the MnPO of adult rats, on the other hand, P2X4, followed by P2X7 andP2X3 showed the highest expression rates.(2) Employing immunohistochemistry on coronal sections derived from transcardially perfusion-fixed adult rat brains, P2X1 and P2X2 could be detected in neurons, and to a limited extent also astrocytes of the MnPO, as well as P2X4 in perivascular microglial cells. Cell type specific proofs for the expression of certain P2X purinoceptor subtypes was made possible by the establishment of a MnPO primary culture system from neonatal rat brains. The P2X1 receptor proved to be expressed by numerous MnPO-intrinsic neurons, astrocytes as well as oligodendrocytes, but not by microglial cells. The P2X2 receptor subtype, on the other hand, was primarily expressed in neurons, and a few astrocytes. The P2X4 receptor subtype could exclusively be demonstrated in microglial cells of the MnPO primary culture system.(3) In detailed pharmacological studies performed on neurons, astrocytes and oligodendrocytes of the established MnPO primary culture, after the cells being loaded with the calcium sensitive fluorescence dye Fura-2 to be able to continuously follow intracellular calcium signalling upon purinergic stimulation, the expression profile of various purinoceptor subtypes was investigated. Subtype-specific agonists and antagonists were employed for the microspectrofluorimetric analysis of intracellular calcium concentration ([Ca2+]iz). Due to only marginal uptake of the Fura-2 into the cytosol, microglial cells had to be excluded from analysis. As the prime agonist for the activation of calcium currents, the ATP analogue 2Me-SATP was employed in addition to the endogenous ligand ATP in superfusion stimulation experiments.(a) Neurons of the MnPO primary culture did not show a clear-cut dose-response relationship with regard to the rise in [Ca2+]iz evoked by superfusion stimulation with 2Me-SATP (10-8 10-6 M/L), whereas astrocytes and oligodendrocytes did. With regard to neurons and oligodendrocytes, the rise in intracellular calcium proved to be exclusively due to influx of extracellular calcium, whereas an additional intracellular calcium store must be taken into consideration for the signalling in astrocytes.(b) Most of the MnPO neurons demonstrated a fast rise in [Ca2+]iz without sigs of desensitization due to stimulation with the agonist 2Me-SATP. In addition, repetitive equimolar stimulations even with short time intervals did now reveal decrement. For numerous neuroglial cells, however, desensitization developed already during ongoing agonist superfusion stimulation. Responsiveness to repetitive stimulations could be influenced in a positive sensem when time intervals between single stimuli were enlarged.(c) In none of the three cell groups of the MnPO primary culture system, P2X1-receptor specific (alpha,betame-ATP), P2X7-receptor specific (Bz-ATP) or adenosine receptor specific (NECA, CCPA) agonists were able to elicit intracellular calcium signalling.(d) In the presence of two-valent Zn2+ ions (10-5 M/L), acting as an allosteric modulator of receptor-ligand binding, calcium currents induced by the agonist 2Me-SATP proved to be potentiated for neurons, but inhibited for neuroglial cells such as astrocytes and oligodendrocytes. All three cell types showed marked inhibition of agonist induced calcium signaliung in the presence of purinoceptor antagonists with a hierarchy of potencies as follows: RB2 > TNP-ATP > PPADS,(4) Proinflammatory cytokines such as TNF-alpha or IL-6 are primarily biosynthesized by astrocytes and microglial cells. Incubation of MnPO primary culture dishs with ATP or 2Me-SATP induced time as well as concentration dependent release of both proinflammatory cytokines, TNF-alpha and IL-6, into the supernatant, as determined by cytokine-specific bioassay systems. Furthermore, cytokine release stimulated by bacterial lipopolysaccharide (LPS) could partially be suppressed by the purinoceptor antagonists PPADS and TNP-ATP.(5) For neurons of the rat MnPO, the functional expression of primarily P2X2 purinoceptors may be postulated based on QRT-PCR analysis of MnPO tissue, the immuncytochemical staining both in brains sections and the MnPO primary culture system, as well as the detailed pharmacological characterization by calcium-based microspectrofluorimetry. Neuroglial cells might, in addition to P2X2, also express functional purinoceptors of the P2X1 or P2X1-like subtype. In addition, the participation of metabotropic purinergic receptors such as P2Y1 cannot be ruled out. With regard to the microglial cells of the MnPO, endogenous ATP might, P2X4 purinoceptor-mediated, induce the release of the proinflammatory cytokines TNF-alpha and IL-6.
Keywords: ddc:630